近年來, 隨著人們對(duì)飼用抗生素帶來的負(fù)面效應(yīng)的認(rèn)識(shí)愈加深入, 我國在養(yǎng)殖業(yè)中規(guī)定允許使用的飼用抗生素的種類越來越少, 并且, 禁用飼用抗生素已是大勢所趨。因此, 研發(fā)飼用抗生素的替代品成為動(dòng)物營養(yǎng)領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)。發(fā)酵飼料作為一類新型、綠色、環(huán)保的飼料, 由于其在生產(chǎn)過程中微生物發(fā)酵可以產(chǎn)生大量有益于動(dòng)物健康的代謝產(chǎn)物, 因而其可以在一定程度上減少養(yǎng)殖過程中飼用抗生素的使用, 從而降低養(yǎng)殖成本。因此, 在畜牧生產(chǎn)中, 發(fā)酵飼料的研發(fā)與推廣備受關(guān)注。近年來, 諸多研究顯示, 在動(dòng)物生產(chǎn)中使用發(fā)酵飼料可維持動(dòng)物消化道微生態(tài)平衡、增強(qiáng)動(dòng)物的免疫力、提高生長性能。然而, 當(dāng)前有關(guān)發(fā)酵飼料在豬生產(chǎn)中的研究仍主要集中于發(fā)酵飼料對(duì)豬生長性能等表型指標(biāo)的影響, 關(guān)于發(fā)酵飼料對(duì)豬機(jī)體整體代謝影響的報(bào)道極少, 對(duì)豬肉品質(zhì)的影響仍不十分清楚。因此, 本試驗(yàn)擬采用基于超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜的代謝組學(xué)技術(shù), 研究發(fā)酵飼料對(duì)生長育肥豬血清代謝產(chǎn)物的影響, 同時(shí)探討飼喂發(fā)酵飼料對(duì)育肥豬生長性能、胴體性狀、肉品質(zhì)、血清生化指標(biāo)的影響, 擬為發(fā)酵飼料在豬生產(chǎn)中的合理應(yīng)用提供相關(guān)試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物、試驗(yàn)飼糧與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選用健康、日齡基本一致, 體重約60 kg的三元雜交豬24頭, 隨機(jī)分為2組, 分別為基礎(chǔ)飼糧組 (對(duì)照組) 和發(fā)酵飼料組 (試驗(yàn)組) , 每組4個(gè)重復(fù), 每個(gè)重復(fù)3頭豬。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧, 試驗(yàn)組飼喂80%基礎(chǔ)飼糧和20%發(fā)酵飼料 (發(fā)酵飼料底物組成同基礎(chǔ)飼糧) ?；A(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

發(fā)酵飼料的制作程序如下:采用南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院消化道微生物實(shí)驗(yàn)室保存的唾液乳桿菌L79、枯草芽孢桿菌B1121和釀酒酵母菌S1145制備菌液, 并按照質(zhì)量比2∶2∶1進(jìn)行混合 (復(fù)合菌總數(shù)量約為1×109CFU/g) , 取對(duì)照組基礎(chǔ)飼糧, 按0.2%復(fù)合菌液添加于飼糧中, 混合均勻后分裝至發(fā)酵袋中, 于37℃發(fā)酵2 d, 飼喂前再與基礎(chǔ)飼糧以1∶4的比例混合, 將混合后的飼料作為試驗(yàn)組飼糧。試驗(yàn)期間, 每日飼喂2次, 自由采食, 自由飲水。預(yù)試期6 d, 正試期29 d。

1.2 樣品采集

正式試驗(yàn)開始后第30天, 將試驗(yàn)豬禁飼12 h后稱重, 禁飼期間自由飲水。隨后, 每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取1頭豬, 頸靜脈采血, 室溫放置20 min后3 000 r/min離心10 min分離血清, -20℃保存;每組選取4頭接近平均體質(zhì)量的豬, 按照常規(guī)流程進(jìn)行屠宰, 檢驗(yàn)檢疫后測定胴體性狀指標(biāo), 并取200 g左右的背最長肌樣品, 存于4℃冰盒中, 用于肉品質(zhì)測定。

1.3 檢測指標(biāo)

1.3.1 生長性能和胴體性狀指標(biāo)測定

試驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)對(duì)試驗(yàn)豬進(jìn)行稱重, 記錄試驗(yàn)豬的采食量, 計(jì)算平均日采食量、平均日增重和料重比。

參照NY/T 825—2004《瘦肉型豬胴體性狀測定技術(shù)規(guī)范》測定育肥豬胴體重、屠宰率、背膘厚。

1.3.2 背最長肌肉品質(zhì)指標(biāo)測定

背最長肌pH45 min、pH24 h、亮度 (L*) 值、紅度 (a*) 值、黃度 (b*) 值、滴水損失、蒸煮損失和剪切力的測定參照NY/T 2793—2015《肉的食用品質(zhì)客觀評(píng)價(jià)方法》。按照美版NPPC比色板進(jìn)行肉色評(píng)分和大理石紋評(píng)分。

1.3.3 背最長肌營養(yǎng)成分測定

利用凱氏定氮法和索氏提取法測定背最長肌樣品中粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、干物質(zhì)含量。

1.3.4 血清生化指標(biāo)測定

采用南京生物工程研究所試劑盒測定育肥豬血清總蛋白 (TP) 、尿素氮 (UN) 、甘油三酯 (TG) 、總膽固醇 (TC) 、葡萄糖 (GLU) 含量及谷丙轉(zhuǎn)氨酶 (ALT) 、谷草轉(zhuǎn)氨酶 (AST) 活性。

1.3.5 血清代謝產(chǎn)物組成測定

取100μL血清置于1.5 mL離心管中, 加0.3 mL甲醇, 10μL內(nèi)標(biāo) (2-氯苯丙氨酸) , 渦旋30 s, 在4℃、12 000 r/min離心10 min, 移取200μL上清, 轉(zhuǎn)入自動(dòng)進(jìn)樣瓶。采用基于超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜的代謝組學(xué)技術(shù), 對(duì)血清進(jìn)行色譜分離和鑒定, 并測定標(biāo)志性差異代謝產(chǎn)物含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Waters Masslynx V4.1軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行峰檢測和峰匹配。每個(gè)樣本的總峰面積歸一化至10000。采用有監(jiān)督的偏最小二乘判別分析 (partial least-square discriminant analysis, PLS-DA) 方法對(duì)樣品進(jìn)行模式識(shí)別分析。潛在標(biāo)志物根據(jù)變異權(quán)重參數(shù)值 (VIP) 、置信區(qū)間得分圖 (scoring plot) 和載荷圖 (loading plot) 進(jìn)行篩選, 用SPSS20.0進(jìn)行獨(dú)立樣品t檢驗(yàn) (independent-sample t test) 方法分析, 再根據(jù)VIP和統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行判別分析。血清生化指標(biāo)等數(shù)據(jù)以平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤的形式表示, 試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2010初步處理后, 采用SPSS 20.0軟件中的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)方法進(jìn)行分析, P<0.05為達(dá)到顯著性水平。

2結(jié) 果

2.1 發(fā)酵飼料中營養(yǎng)成分的變化

由表2可知, 發(fā)酵飼料中粗蛋白質(zhì)、粗纖維含量及干物質(zhì)消失率高于基礎(chǔ)飼糧 (P>0.05) , 粗脂肪含量低于基礎(chǔ)飼糧 (P>0.05) 。

本試驗(yàn)期間, 2組育肥豬的生長性能和胴體性狀雖無顯著差異, 但飼喂發(fā)酵飼料的試驗(yàn)組育肥豬的料重比在數(shù)據(jù)上低于對(duì)照組, 宰前活重、胴體重、屠宰率、眼肌面積在數(shù)據(jù)上均高于對(duì)照組, 并且背膘厚較低。導(dǎo)致該結(jié)果的原因可能是與試驗(yàn)豬處于生長發(fā)育后期有關(guān), 此時(shí), 育肥豬采食量大, 外源添加物難以在短時(shí)間內(nèi)有效地改變其生長速度, 此外, 本研究所用豬的數(shù)量相對(duì)較少。因此, 有關(guān)發(fā)酵飼料對(duì)豬的生長性能的影響還需進(jìn)一步研究。

動(dòng)物血清生化指標(biāo)可反映動(dòng)物的生理代謝和健康情況。血清中的總蛋白在維持血管內(nèi)膠體滲透壓、運(yùn)輸養(yǎng)分等功能中具有重要的作用, 可反映機(jī)體本身的營養(yǎng)狀況和對(duì)蛋白質(zhì)的消化吸收情況。血清中的總蛋白含量越高, 表明機(jī)體合成蛋白質(zhì)的能力越強(qiáng)。本試驗(yàn)中, 試驗(yàn)組育肥豬血清中總蛋白含量顯著高于對(duì)照組, 說明豬的蛋白質(zhì)合成能力增強(qiáng)。尿素氮是機(jī)體蛋白質(zhì)和氨基酸等組分的代謝產(chǎn)物, 其含量可相對(duì)準(zhǔn)確地反映出動(dòng)物體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝和氨基酸代謝的平衡。本試驗(yàn)中, 試驗(yàn)組育肥豬血清中尿素氮含量顯著高于對(duì)照組, 說明飼喂發(fā)酵飼料促進(jìn)機(jī)體蛋白質(zhì)的分解代謝。由此, 基于飼喂發(fā)酵飼料組育肥豬血清中總蛋白和尿素氮含量皆高于對(duì)照組, 本試驗(yàn)認(rèn)為發(fā)酵飼料可能促進(jìn)了機(jī)體蛋白質(zhì)整體代謝, 這也可能是2組豬的生長性能沒體現(xiàn)出差異的原因之一。

本研究利用代謝組學(xué)研究手段, 研究發(fā)現(xiàn)飼喂發(fā)酵飼料顯著影響了育肥豬血清中L-焦谷氨酸、黃嘌呤、丁子香酚、丙烯酰胺和對(duì)-香豆酸含量。在這些代謝產(chǎn)物中, L-焦谷氨酸是谷胱甘肽的分解產(chǎn)物之一, 血清中L-焦谷氨酸含量下降, 說明飼喂發(fā)酵飼料可在一定程度上降低谷胱甘肽的分解代謝, 此結(jié)論與前文所述發(fā)酵飼料可增強(qiáng)育肥豬機(jī)體蛋白質(zhì)整體代謝這一結(jié)論相符。研究發(fā)現(xiàn), 谷胱甘肽可減少蛋白巰基被氧化導(dǎo)致的酶失活, 并可與體內(nèi)自由基結(jié)合加速其向酸類物質(zhì)的還原過程, 因而其可減輕自由基對(duì)機(jī)體重要臟器的損傷。由此, 谷胱甘肽分解代謝減弱對(duì)維持機(jī)體健康有著積極作用。本試驗(yàn)中育肥豬血清代謝產(chǎn)物中的對(duì)-香豆酸與丁子香酚主要來自于微生物發(fā)酵飼料生成, 與對(duì)照組相比, 其在試驗(yàn)組的育肥豬血清中含量升高, 原因可能與飼料發(fā)酵生成有關(guān)。相關(guān)研究表明, 對(duì)-香豆酸與丁子香酚均具有良好的抗氧化活性, 上述物質(zhì)含量上升暗示發(fā)酵飼料具有增強(qiáng)育肥豬抗氧化應(yīng)激的作用。本研究中, 飼喂發(fā)酵飼料的育肥豬血清中的丙烯酰胺和黃嘌呤含量上升, 出現(xiàn)該結(jié)果的具體原因尚不清楚。

肉色是影響豬肉感官的重要指標(biāo)。研究表明, 飼喂發(fā)酵飼料可使豬肉肉色更加鮮艷。本試驗(yàn)中, 試驗(yàn)組育肥豬背最長肌a*值、肉色評(píng)分顯著高于對(duì)照組, 原因可能與試驗(yàn)組育肥豬血清中的對(duì)-香豆酸、丁子香酚含量增多和機(jī)體谷胱甘肽代謝降低有關(guān)。如前所述, 對(duì)-香豆酸與丁子香酚具有抗氧化活性, 能夠抑制細(xì)胞膜脂質(zhì)的過氧化反應(yīng), 從而延緩肌肉中肌紅蛋白被氧化為導(dǎo)致肉色變暗的高鐵血紅蛋白。因此試驗(yàn)組的育肥豬血清中對(duì)-香豆酸與丁子香酚含量升高, 暗示發(fā)酵飼料具有提高肉的色澤和亮度及改善肉色的功能。嫩度是豬肉口感的重要物理指標(biāo), 是豬肉質(zhì)地的反映, 而剪切力是評(píng)定肌肉嫩度的客觀指標(biāo), 其平均剪切力越高, 肉越老。有研究表明, 嫩度與豬背最長肌內(nèi)脂肪含量和肉的保水量相關(guān), 肉的保水性增加可減少汁液損失, 從而提高嫩度。相關(guān)研究表明, 育肥豬飼糧中添加發(fā)酵飼料可有效改善豬肉品質(zhì), 提高肌內(nèi)脂肪含量, 顯著降低背最長肌的剪切力值。本試驗(yàn)結(jié)果顯示, 試驗(yàn)組育肥豬背最長肌中脂肪含量顯著高于對(duì)照組, 且蒸煮損失低于對(duì)照組, 剪切力也顯著低于對(duì)照組, 結(jié)果也與上述文獻(xiàn)報(bào)道相符。造成上述結(jié)果的原因可能是飼喂發(fā)酵飼料增強(qiáng)了機(jī)體抗氧化能力, 進(jìn)而增強(qiáng)了機(jī)體的抗應(yīng)激能力, 從而使屠宰后背最長肌細(xì)胞中糖酵解速度減慢, 進(jìn)而導(dǎo)致其pH下降速度顯著慢于對(duì)照組。研究顯示, 較慢的pH下降速度可降低肌紅蛋白、肌動(dòng)蛋白等蛋白質(zhì)的變性程度, 從而使肌肉色澤更加鮮艷、嫩度提升、系水力增強(qiáng), 該結(jié)果也暗示發(fā)酵飼料可能具有改善肌肉的食用品質(zhì)的功能。

4結(jié) 論