高產酸菌株的篩選、鑒定及其混菌發酵對菜籽粕營養價值的影響

2021-05-29 10:16:14 點擊：

摘要：本實驗從泡菜水中分離得到一株高產有機酸的乳桿菌，并將該菌株與黑曲霉混合后結合兩步法處理菜籽粕，同時降解菜籽粕中的硫苷和大分子蛋白并提高總酸含量，從而提高菜籽粕的營養價值。該株乳桿菌經16S rDNA鑒定，確定為類食品乳桿菌(Lactobacillus paralimentarius)。將該菌株與黑曲霉混合后結合兩步法處理菜籽粕后，其營養價值得到了一定提高，與空白對照和單菌發酵相比，總酸含量分別提高了640.54%、160.95%和112.40%;酸溶蛋白和氨基酸態含量分別從2.87%和 0.12%提高到19.08%和1.23%;硫苷含量從23.09μmol/g下降到12.65μmol/g。結果表明，混菌發酵結合兩步法有利于改善菜籽粕的營養價值，對擴大菜籽粕的利用奠定了基礎。

菜籽粕是菜籽經榨油后的副產物，其粗蛋白含量為35%～42%，碳水化合物含量為20%～25%，粗纖維含量為12%～13%，且氨基酸組成平衡，是一種優質的植物蛋白資源，近年來常被作于制備多肽及作為動物日糧。由于其中含有硫苷、植酸等抗營養因子，限制了其在食品、動物日糧中的應用價值。為提高菜籽粕應用價值，國內外學者已對其抗營養因子的降解進行了大量研究，如物理法、化學法、酶法、微生物發酵法等。因微生物發酵法相比于物理、化學、酶法具有成本低、營養物質損失少、發酵降解抗營養因子的同時能提高蛋白營養價值等優點而受到廣泛關注。近年來，大量研究中常用到乳酸菌、曲霉、枯草芽孢桿菌等進行固態發酵降解菜籽粕抗營養提高小肽含量。吳正可等通過嗜酸乳桿菌發酵菜籽粕后，將總酸從1.01%提高至3.10%，硫苷從37.48μmol/g降至28.60μmol/g，有效改善了其營養價值。Shi等研究結果表明通過黑曲霉發酵菜籽粕72h后，將菜籽粕中硫苷從41.91μmol/g降低至23.86μmol/g，小肽含量從2.57%提高至8.39%，但并不能提高酸度改善風味。

雖然將乳酸菌應用于菜籽粕發酵能提高菜籽粕總酸含量和改善其風味，但對于降解硫苷、大分子蛋白的能力有限。鑒于黑曲霉在發酵的過程中能產生多種酶系，對降解抗營養因子及分解大分子蛋白效果顯著。因此，在本研究中，將乳酸菌和黑曲霉混菌發酵同時結合兩步法進一步降解菜籽粕中的抗營養因子和分解大分子蛋白，以達到改善菜籽粕營養價值的目的，擴大菜籽粕的應用范圍。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑曲霉：中國工業菌種保藏中心(CICC);

乳桿菌：泡菜水中分離;

泡菜水：三種市售泡菜水;

菜籽粕、麩皮：樂山恒峰華邦科技有限公司;

LBS 培養基：北京某生物技術有限責任公司;

過氧化氫酶試劑盒：上海某生物科技有限公司;

細菌 DNA 提取試劑盒：杭州新景生物試劑開發有限公司;

其他試劑均為國產分析純：成都市科隆化學品有限公司。

SW-CJ-2D：雙人單面凈化工作臺蘇州凈化設備有限公司;

K9840 自動凱氏定氮儀：山東海能科學儀器有限公司;

AT-710 電位自動滴定計：KyotoElectronicsMFG公司;

BCD-571WDPF 冰箱：海爾集團電器產業有限公司;

T－114 型分析天平：北京賽多利斯儀器系統有限公司;

T6 紫外-可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司;

QYC－2102C 型恒溫培養搖床：上海福馬實驗設備有限公司;

MF80BSH-2型霉菌培養箱：上海新苗醫療器械制造有限公司;

LS-75HD 立式高壓蒸汽滅菌器：江陰濱江醫療設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基的配置

MRS液體培養基:蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉5g，葡萄糖5g，乙酸鈉5 g，檸檬酸二銨2g，Tween－80 1g，K2HPO4 2g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·H2O 0.05g，去離子水1.0L，pH6.8，121℃滅菌15min。

MRS瓊脂培養基:同MRS液體培養基，向其中添加20g瓊脂，121℃滅菌15 min。

黑曲霉菌麩皮種子培養基:麩皮∶水=2∶1(W/V)，混勻后取30g裝入500mL三角瓶，121℃滅菌15min。

菜籽粕發酵培養基:菜籽粕∶麩皮=72∶28(W/W)，添加含0.12%吐溫溶液，使其水分含量為58%(W/W)，混勻后取60g裝入500mL三角瓶，121℃滅菌15min。

1.2.2 高產酸乳桿菌分離篩選

初篩:將泡菜水中分離得到的76株乳桿菌分別于LBS培養基劃線，并于37℃培養3d，挑取生長快，單菌落為灰白色，直徑在0.5～0.25mm的菌株進行過氧化氫酶接觸試驗，對酶接觸試驗呈陰性的菌株進行復篩。

復篩:將初篩獲得的菌株接種于MRS培養基中，37℃培養18h。培養后，按1%接種量接種于菜籽粕發酵培養基，混勻，裝入自封袋并排出空氣，37℃厭氧發酵24h，發酵結束后測定總酸，選擇發酵菜籽粕產酸優勢乳桿菌，以接種無菌MRS 培養基替代乳桿菌種子液做空白對照。

1.2.3 菌株鑒定

通過細菌DNA提取試劑盒法提取優勢菌株基因組后，用細菌16S rDNA通用引物進行PCR擴增。PCR反應條件為:預變性:98℃，5min;變性:98℃，10s;退火:55℃，15s，延伸:72℃，20s;循環數:35;終延伸:72℃，5min。將PCR擴展產物送至成都擎科梓熙生物技術有限公司進行測序。將測序序列與GenBank核酸序列數據庫進行BLAST同源性對比分析，運用Mega 7.0構建系統發育樹，確定所選菌株種屬。

1.2.4 菌株生長曲線

將保藏于斜面的乳桿菌接種于MRS液體培養基中并于37℃培養12h后，按1%接種量(V/V)接種于250mLMRS培養基中，37℃靜置培養36h，每隔3h取樣1次，于600nm處測定OD值，確定菌體濃度。

1.2.5 乳桿菌發酵溫度對產酸的影響

將篩選得到的乳桿菌按1.2.2中復篩的方法接種發酵菜籽粕，探討不同發酵溫度(35、36、37、38、39、40、41、42和43℃)對乳桿菌發酵菜籽粕產酸的影響。

1.2.6 混菌發酵結合兩步法對發酵菜籽粕產酸的影響

黑曲霉麩曲種子:將斜面保藏的黑曲霉用接種環勾取3環接種于種子培養基中，30℃恒溫培養72h;乳桿菌發酵種子液:將復篩的乳桿菌按1%接種量(V/V)接種于MRS液體培養基中，于37℃下，按1.2.4中確定的最佳培養時間培養。

兩步法—發酵:將黑曲霉麩曲種子按3%(W/W)接種量接種于菜籽粕發酵培養基中，混勻，28℃發酵48h;發酵結束后，將發酵后的菜籽粕裝入自封袋中，按1%接種量(V/W)接種乳桿菌種子液，混勻并排出自封袋空氣后于1.2.5中確定的最佳溫度下發酵，于不同發酵時間下測得總酸和還原糖含量。

兩步法—酶解:操作與兩步法步驟相同，僅用接種無菌水替換接種乳桿菌，于 1.2.5中確定的最佳溫度下對發酵菜籽粕進行酶解處理，于不同酶解時間下測定總酸和還原糖含量。

乳桿菌發酵:于菜籽粕發酵培養基中接種1%乳桿菌種子液(V/W)并于1.2.5 中確定的最佳溫度下進行發酵，于不同發酵時間下測定總酸含量。

空白對照:以未接種黑曲霉和乳桿菌進行兩步法處理或未接種乳桿菌、黑曲霉進行單菌發酵的菜籽粕為空白對照。

1.2.7 混菌發酵結合兩步法對發酵菜籽粕過程中硫苷、酸溶蛋白、氨基酸態氮含量變化

按1.2.6中兩步發酵方式對菜籽粕進行發酵，測定發酵過程中硫苷、酸溶蛋白、氨基酸態氮含量變化，同時對酶解過程中硫苷含量進行測定，確定兩步發酵對硫苷降解的影響。

1.2.8 指標的測定

總酸:根據GB/T 12456－2008測定，結果以乳酸計。

還原糖:采用DNS法測定。

酸溶蛋白:參考GB/T 22492－2008測定。

氨基酸態氮:根據GB 5009.235－2016測定。

1.3 數據處理

每次試驗設置三個平行，試驗結果采用平均值±標準誤差表示，使用SPSS 22.0進行單因素方差分析，并采用Duncan 檢驗法進行多重比較，以P＜0.05作為差異性顯著判斷標準。

2 結果與分析

2.1 高產酸的乳桿菌初篩與復篩

通過LBS乳桿菌選擇培養基篩選出了34株長勢良好且過氧化氫酶接觸試驗呈陰性的菌株。通過固態發酵菜籽粕試驗對34株菌進行復篩，結果如圖1所示。

結果表明，相比于未添加乳桿菌發酵的空白對照，除a1和a3外，其他32株乳桿菌產酸能力都較好，總酸含量顯著提高(P＜0.05)。分別經a2，a11，c5，c10，c11，c13發酵菜籽粕后，總酸含量均從0.31%提高至1%以上，尤其經c10發酵后，總酸含量最高，達到1.24%，與空白相比提高了300%。說明乳桿菌c10在菜籽粕中生長良好，且能利用菜籽粕中多種糖類發酵并產生大量酸性物質，使得總酸含量大幅提高，因此選擇c10用于后續研究。

2.2 乳桿菌菌株鑒定

通過PCR對c10基因組中16S rDNA擴增后送至擎科生物有限公司測序，將測序所得序列與NCBI數據庫中已收錄DNA序列進行BLAST對比，并構建系統發育樹(圖2)。結果表明，c10為乳桿菌屬，與類食品乳桿菌( Lactobacillusparalimentarius DSM 13238)的相似性達99.37%，因此確定c10為類食品乳桿菌。

2.3 乳桿菌生長曲線

圖3為類食品乳桿菌生長曲線。結果表明，0～3h為生長延滯期，3h后，進入對數生長期，菌體濃度迅速增加。到12h后，可能進入對數末期，菌體濃度緩慢增加。為保證接種的乳桿菌處于對數生長期，在后續試驗中，均選擇培養12h的處于對數生長期的菌種活化液作為發酵菜籽粕種子液。

2.4 溫度對類食品乳桿菌發酵菜籽粕產酸的影響

圖4為類食品乳桿菌于不同溫度下發酵24h后菜籽粕中總酸含量變化情況。結果表明，37～40℃為發酵菜籽粕產酸的最佳溫度，當發酵溫度低于37℃或高于40℃時，總酸含量顯著降低(P＜0.05)。可能由于溫度過低或過高，乳桿菌生長代謝、胞內外酶活性受到抑制，從而影響產酸的相關代謝途徑，導致發酵后菜籽粕中總酸含量較低。

由于黑曲霉在發酵菜籽粕過程中能產生蛋白酶、纖維素酶等，發酵結束后進一步提高溫度進行酶解，可將菜籽粕中大分子營養物降解為小分子營養物。因此在第二步厭氧發酵(乳桿菌發酵)過程中，適當提高環境溫度將有利于提高蛋白酶、纖維素酶活性，為乳桿菌提供大量可發酵碳氮源，促進乳桿菌發酵菜籽粕產酸，同時利于蛋白酶將菜籽粕中大分子蛋白分解為小肽。由于39℃利于乳桿菌發酵產酸，且與蛋白酶作用溫度接近，因此將39℃作為第二步乳桿菌發酵溫度。

2.5 混菌發酵結合兩步法對發酵菜籽粕總酸含量的影響

如圖5A所示，經黑曲霉發酵后，總酸含量從0.37%提高至1.05%。由于黑曲霉可利用多種碳源發酵產生檸檬酸等有機酸，因此，在第一步黑曲霉有氧發酵中，菜籽粕中部分糖類被黑曲霉轉化為有機酸，使得發酵后菜籽粕總酸含量提高。將黑曲霉發酵后的菜籽粕接種類食品乳桿菌進行厭氧發酵后，總酸含量進一步提高。厭氧發酵至3h時，總酸含量變化較小，發酵3h后，總酸含量被顯著提高，當發酵至12h后，總酸含量無顯著變化(P＜0.05)。當兩步法發酵至12h時，總酸含量達到2.74%，與黑曲霉單菌發酵和空白對照比較可知，其總酸含量分別提高160.95%和640.54%。將黑曲霉發酵后的菜籽粕進行酶解后，總酸含量無顯著性差異(P＞0.05)，表明在酶解過程中，黑曲霉發酵產生的酶不影響總酸含量，且在第二步乳桿菌厭氧發酵過程中，總酸含量的變化主要由乳桿菌發酵糖類產生有機酸引起。

圖5B為兩步法過程中的還原糖含量的變化情況。結果表明，發酵菜籽粕于39℃下進行酶解后，還原糖含量明顯增加。當酶解至12h時，菜籽粕中還原糖含量達到30.09mg/g，相比于黑曲霉有氧發酵結束后，還原糖含量提高了272.86%，延長酶解時間，還原糖含量無顯著差異(P＞0.05)。當菜籽粕經黑曲霉發酵后，仍有大量多糖未被降解，這些物質在酶解階段能被黑曲霉發酵產生的多糖水解酶水解，因此使得菜籽粕中還原糖含量明顯增加。當接種類食品乳桿菌進行厭氧發酵至12h后，還原糖含量為17.94mg/g，相比39℃酶解12h，還原糖含量下降了40.38%。在添加乳桿菌進行厭氧發酵過程中，酶將多糖分解為還原糖的同時，乳桿菌利用這些還原糖發酵產生有機酸，因此相比酶解菜籽粕中，還原糖含量大幅下降，并且總酸含量明顯提高。

如圖5C所示，經類食品乳桿菌單獨發酵菜籽粕24h，總酸含量提高至1.29%，延長發酵時間，總酸含量無顯著差異(P＞0.05)。兩步法縮短了乳桿菌發酵菜籽粕達到最大產酸量的時間，且相比類食品乳桿菌單獨發酵菜籽粕總酸含量提高了 112.40%。可能的原因是，在兩步發酵過程中，多種酶將菜籽粕中多種大分子物質分解為小分子物質，乳桿菌可利用的小分子營養物質不斷增多，加快了其生長代謝速率，因此縮短了產酸時間，同時在此過程中還原糖含量不斷增加，經乳桿菌發酵后，總酸含量進一步提高。

2.6 混菌發酵結合兩步法對硫苷含量的影響

黑曲霉在發酵48h后進入酶解階段，結果如表1所示，將黑曲霉發酵后的菜籽粕于39℃酶解后，硫苷含量明顯降低，經酶解12h后，硫苷含量降低為13.29 μmol/g，隨著酶解時間的延長，其含量無顯著變化(P＞0.05)。此結果與黑曲霉一步發酵后接種乳桿菌于39℃發酵12h后的硫苷含量無顯著差異(P＞0.05)，表明類食品乳桿菌在第二步厭氧發酵產酸過程中的相關代謝活動不會對黑曲霉分泌的相關酶系分解硫苷產生影響。當兩步發酵菜籽粕至12h后，硫苷、總酸含量均無顯著變化(P＞0.05)，因此在后續試驗中僅關注兩步發酵12h后菜籽粕中酸溶蛋白及氨基酸態氮含量變化，確定兩步發酵的最佳發酵時間。

2.7 混菌發酵結合兩步法對酸溶蛋白和氨基酸態氮含量的影響

表2為混菌發酵結合兩步法對酸溶蛋白和氨基酸態氮含量的影響。結果2.5表明，經兩步發酵12h后，總酸含量不再隨發酵時間延長而變化，但酸溶蛋白、氨基酸態氮含量均隨發酵時間延長而增加。當發酵至18h后，酸溶蛋白及氨基酸態氮含量分別提高至19.08%和1.23%，且不隨發酵時間延長而改變(P＞0.05)，相比黑曲霉單步發酵后分別提高78.48%和68.27%。因此確定兩步發酵的最佳發酵時間為18h。之前的研究表明，將黑曲霉發酵后的菜籽粕進一步酶解后，由于菜籽粕中大分子蛋白被黑曲霉發酵產生的相關蛋白酶分解，將大幅度提高菜籽粕中小分子蛋白含量。因此，在本研究中，將發酵的菜籽粕接種乳桿菌進行兩步發酵后，總酸含量被提高的同時酸溶蛋白及氨基酸態氮含量也被大幅提高。

3 結論

本實驗從泡菜水中篩選出一株高產有機酸的乳桿菌，經16S rDNA測序鑒定為類食品乳桿菌(Lactobacillus paralimentarius)，并確定其發酵菜籽粕產酸的最佳條件。將乳酸菌與黑曲霉混合發酵同時結合兩步法作用于菜籽粕后，與空白對照和單菌發酵相比，其總酸含量分別提高了640.54%、160.95%和112.40%;酸溶蛋白和氨基酸態氮含量分別從2.87%和0.12%提高到19.08%和1.23%，其提高率達到了564.81%和925%;硫苷含量從23.09μmol/g下降到12.65μmol/g，其降解率為45.21%。以上結果表明，菜籽粕先經黑曲霉發酵產酶再接種乳桿菌兩步法處理后，硫苷含量顯著下降，菜籽粕的營養價值顯著提高，其品質得到了很大的改善，對擴大菜籽粕在食品和飼料中的開發與利用具有實際意義。

發酵完成的棉菜粕飼喂動物技術

需要注意的是，發酵后的飼料酸度較低，不可以取代禽畜全部日糧。其他類發酵飼料同理。飼喂時根據不同情況，將發酵飼料按照一定比例添加到日糧中，發酵完成的棉菜粕為濕料，具體使用量每大概1.5-2公斤發酵棉菜粕（濕料）代替動物日糧配方中1公斤豆粕的使用量進行代替使用，與其它飼料混合后直接飼喂，由于棉菜籽粕蛋白較高，最高使用量不要超過禽畜日糧飼喂量的40%（濕料重量）。如果發現發酵飼料過酸適口性變差，可在飼喂前在陽光下曬1-2小時，或添加適量的碳酸氫鈉（小蘇打）即可改善。

發酵過程中與發酵后使用過程中，發酵的容器要一直保持密封狀態，可以長時間保存（一年左右）。

當前養殖業成本高居不下，而飼料成本是其中最高的，利用廉價原料發酵飼料（包括一些輕度發霉的粕類低價收回）是極佳解決辦法。通過微生物飼料發酵劑的發酵作用，可以將輕度霉變飼料變成優質飼料，將不易消化的物質分解為可被畜禽吸收的小分子糖類、氨基酸等。同時發酵飼料中富含有益微生物、酶制劑、酸化劑等，可調節畜禽腸胃微生態環境并進一步提高飼料利用率。發酵飼料氣味清香，提高了飼料的適口性，加上發酵飼料中有大約4℃的酒度，能夠促進動物新陳代謝促進健康抵御疾病，是當前養殖業發展中重要的一環。

本技術也可以同樣發酵菜籽粕（餅）、棕櫚粕等，方法同上。

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