蠟樣芽孢桿菌與糞腸球菌協同發酵豆粕工藝條件優化

2020-04-30 15:58:51 點擊：

摘要：試驗研究了不同發酵條件對發酵豆粕品質的影響，采用單因素優化，逐級遞進法，對豆粕發酵條件進行了優化。以豆粕為原料，以益生蠟樣芽孢桿菌和糞腸球菌作為發酵菌種進行固態發酵試驗研究，主要考察其對發酵產物酸溶蛋白和總有機酸的影響。結果表明，豆粕固體發酵最優工藝條件為：發酵菌種比2：1（蠟樣芽孢桿菌菌液：糞腸球菌菌液=2：1）、發酵初始含水量45%，發酵時間54h、好氧與厭氧時間比2：1，在此發酵條件下酸溶蛋白達到14.95%、總有機酸2.47%、抗原蛋白降解率在90%以上。

豆粕是大豆油加工的副產品，也是理想型動物飼料原料之一，營養物質豐富，其中蛋白質含量約為45%，碳水化合物約為15%，氨基酸平衡（其中賴氨酸含量最高），且價格相對低廉，在畜牧業中起著重要的作用。豆粕含有多種抗營養因子，主要分為4大類：熱敏型、熱穩定型、抗維生素因子、其他抗營養因子。熱穩定型抗營養因子，包括植酸、寡糖、單寧、抗原蛋白，抗原蛋白以大豆球蛋白和β-伴豆球蛋白為主。發酵豆粕有助于提升豆粕風味，降解抗營養因子，增加動物對豆粕營養物質的消化吸收率。益生微生物，如乳酸菌、酵母菌、芽孢桿菌等，可在數量上或種類上對腸道內減少或缺乏的益生微生物進行補充，調節腸道微生物平衡，增強機體消化吸收，增強免疫力，以提高飼料轉化率、畜禽生產性能及防病治病等目的，同時可以降低畜禽產品的膽固醇含量，減少硫化氫等有毒有害物質，滿足畜牧業綠色、安全、可持續發展戰略。本研究以豆粕為發酵原料，將豆粕經熟化后，利用益生微生物發酵，比較不同菌種對豆粕發酵后粗蛋白質、酸溶蛋白以及總有機酸的影響，獲得優勢菌株，并在此基礎上，利用微生物協同發酵豆粕，研究不同發酵條件下，對發酵豆粕指標的影響，得出較佳發酵條件，為后期中試奠定基礎。

1材料與方法

1.1 材料與試劑

豆粕（46%蛋白）由良海糧油有限公司提供；假絲酵母、糞腸球菌、地衣芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌由浙江科峰生物科技有限公司提供。硼酸、濃硫酸、氫氧化鈉、硫酸銅、硫酸鉀、乙醇、三氯乙酸、甲基紅、溴甲酚綠、甘氨酸、TRIS等均為分析純，購自試劑公司。

1.2 試驗儀器

JY1002電子天平，上海天美天平儀器有限公司；JA1003N電子天平，上海精密科學儀器有限公司；YJ875A型超凈工作臺，吳江偉峰凈化設備有限公司；XFLS-40MB壓力蒸汽滅菌鍋，浙江新豐醫療器械有限公司；202A電熱恒溫干燥箱，上海錦屏儀器儀表有限公司；HC-3018高速離心機，科大創新股份有限公司中佳分公司；SPX-100/150/250BZ生化培養箱，上海博迅實業有限公司；CXC-06粗纖維測定儀、KDN-20C消化爐、KDN-04B凱氏定氮，浙江托普云農科技股份有限公司；DYY-6C電泳儀，北京六一生物科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 豆粕發酵菌株的篩選

分別取6kg豆粕原料，分12組，100℃熟化15min，待冷卻至室溫后，按接種量10%分別接種地衣芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、假絲酵母、糞腸球菌，并補水至飼料總含水量為42%，攪拌均勻后于室溫培養，即固態發酵，分為厭氧與好氧發酵，發酵時間48h，每組3個平行。將發酵48h的飼料于90℃烘干，并粉碎，過60目篩，檢測粗蛋白質、酸溶蛋白（相對粗蛋白質）、總有機酸（以乳酸計）。

1.3.2 粗蛋白質的測定

粗蛋白含質量測定參照國標GB 5009.5—2016。

1.3.3 水分的測定

水分含量測定參照國標GB/T 6435—2006。

1.3.4 酸溶蛋白（相對粗蛋白質）的測定

酸溶蛋白含量測定參照國標GB/T 2653—2004。

1.3.5 粗纖維的測定

粗纖維含量的測定參照國標GB/T 6434—2006。

1.3.6 總有機酸（以乳酸計）的測定

總有機酸的測定參照國標GB/T 5009.157—2003。

1.3.7 抗原蛋白降解情況分析

十二烷基磺酸鈉——聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）

樣品處理：取1g粉碎樣品（原料和發酵樣品），加入20.0mL0.03mol/L的Tris-HCl（含0.01mol/Lβ-巰基乙醇），室溫下浸泡1h（每10min攪拌一次），5000r/min離心20min，取上清80μL，加入20μL5×樣品緩沖液，作為上樣樣品，進行SDS-PAGE。對比蛋白條帶，直接定性判定抗原降解情況。

1.3.8 發酵條件優化

單因素發酵條件優化試驗：對菌種比例（蠟樣芽孢桿菌：糞腸球菌）（1：3、1：2、1：1、2：1、3：1），發酵初始含水量（35%、38%、40%、45%、50%），發酵時間（36h、42h、48h、54h、60h）和好氧與厭氧發酵時間比（1：3、1：2、1：1、2：1、3：1）等不同的發酵條件進行研究，其中每優化一個發酵條件的最佳條件作為后續研究。

2結果與分析

2.1 不同菌株對豆粕發酵的影響（見表1）

本試驗過程中，蠟樣芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌起溫快，其次是假絲酵母，次之為糞腸球菌，通過對發酵樣品粉碎處理后，假絲酵母發酵后的豆粕氣味帶有獨特的酵母芳香味且顏色為黃色，兩株芽孢桿菌均帶有氨味且顏色為深黃色至褐黃色，糞腸球菌帶有乳酸香味且顏色為淡黃色。如表1所示，假絲酵母在好氧條件下，對粗蛋白質的提升優于厭氧發酵，總酸指標差于厭氧發酵；地衣芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌在好氧條件下，對提升粗蛋白質和酸溶等方面優于厭氧發酵，總酸則低于厭氧發酵總體來說，蠟樣芽孢桿菌優于地衣芽孢桿菌；糞腸球菌在好氧或厭氧條件下發酵對蛋白質的提升差異不顯著，但厭氧條件下總酸顯著高于好氧發酵。因此，選擇蠟樣芽孢桿菌和糞腸球菌作為后續試驗研究菌株。

2.2 不同菌種比例對酸溶蛋白和總酸的影響（見圖1）

由圖1可知，在好氧條件下，酸溶蛋白隨著蠟樣芽孢桿菌添加比例的上升逐漸增加，菌種比例達到2：1后，基本不變，此時，酸溶蛋白達到12.76%，總酸整體趨勢則相反，因糞腸球菌產乳酸需要厭氧環境，此條件下，菌體生長基本被抑制，考慮到發酵風味及色澤，選擇菌種添加比例為2：1作為后續研究。

2.3 發酵初始含水量對酸溶蛋白和總酸的影響（見圖2）

由圖2可知，豆粕中初始含水量對發酵后期酸溶蛋白和總酸的影響較大，在研究范圍內，酸溶蛋白和總酸隨著含水量上升，呈現正相關，含水量達到45%時，發酵48h粉碎樣品顏色為褐黃色且氣味略帶氨味，含水量達到50%時，發酵后期，明顯的氨臭味，且十分黏稠，整體感官較差，故選擇初始含水量為45%作為后續研究。

2.4 發酵時間對酸溶蛋白和總酸的影響（見圖3）

由圖3可知，發酵時間的變化對整體酸溶蛋白含量有較大影響，而總酸影響并不大，可能是由于蠟樣芽孢桿菌和糞腸球菌均可產生部分有機酸，但在好氧條件下，糞腸球菌生長被抑制，而后期由于物料黏度上升，透氣性下降，出現厭氧條件，其開始生長，有機酸積累開始加快，考慮到發酵豆粕感官，以及相應的指標，選擇發酵54h作為后續研究，此時，酸溶蛋白含量達到15.95%，總酸1.78%。

2.5 好氧與厭氧發酵時間比對酸溶蛋白和總酸的影響（見圖4）

本試驗選擇54h作為發酵終止時間，結合工藝，首先進行好氧發酵，選擇發酵時間：13.5、18.0、27.0、36.0、40.5h，后續采用厭氧發酵（呼吸袋抽真空），選擇發酵時間40.5、36.0、27.0、18.0、13.5h。結果如圖4所示，總酸隨著好氧時間的增加而逐漸降低，但可以發現，時間比在1：1之后，總酸下降幅度減小，可能是由于蠟樣芽孢桿菌產有機酸，彌補了糞腸球菌的產酸空白部分，酸溶蛋白則是呈現增加趨勢，考慮到整體指標和感官指標，選擇2：1比例較佳，此時酸溶蛋白達到14.95%，總酸達2.47%。

2.6 最佳發酵條件下發酵豆粕中抗原蛋白的降解情況分析（見圖5）

由圖5可知，泳道1為發酵菌比（2：1），發酵水分45%，發酵時間54h，好氧與厭氧發酵時間比（2：1）條件下，發酵豆粕粉碎成品的蛋白電泳圖，抗原蛋白主要包括α-大豆球蛋白和β-伴豆球蛋白，從圖中分析，幾乎看不到抗原蛋白的條帶，介于0%豆粕~10%豆粕原料蛋白條帶之間，抗原蛋白的降解率在90%以上，故在該試驗條件下，酸溶蛋白，總酸及抗原蛋白降解率均獲得較佳結果。

3討論

本試驗研究了不同發酵條件對發酵豆粕品質的影響，采用單因素優化，逐級遞進法，對豆粕發酵條件進行了優化。通過指標檢測，獲得最佳發酵條件：蠟樣芽孢桿菌與糞腸球菌菌液為2：1，發酵初始含水量為45%，發酵時間54h，好氧與厭氧發酵時間比為2：1。在最佳發酵條件下酸溶蛋白為14.95%，總酸2.47%，抗原蛋白降解率在90%以上。本研究以豆粕為原料，蠟樣芽孢桿菌和糞腸球菌協同發酵，拓寬了發酵豆粕的菌種選擇范圍，可為后期發酵豆粕的優質高效生產奠定基礎。

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