（3） 樣本采集與處理

在養(yǎng)殖28和56 d時各采樣1次，其中28 d時僅測定體長、體重，并每桶取3條魚解剖取肝臟稱重。取樣前停食24 h，先對各桶魚進(jìn)行計數(shù)，稱重，測量體長，計算特定生長率。每桶取3尾規(guī)格基本一致的魚，先用MS⁃222麻醉，然后用70%酒精擦拭魚體表面，在超凈臺內(nèi)無菌操作，解剖、分離并取出肝臟，對肝臟稱重，分離并取出中后腸段的內(nèi)容物，然后用滅菌解剖刀刮取腸道內(nèi)側(cè)黏膜，與內(nèi)容物混合后，液氮速凍，-80℃保存。

（4）生長指標(biāo)的計算

增重率（%）=[（終末體重–初始體重）/初始體重] ×100

特定生長率（%/d）= [（ln終末體重–ln初始體重）/養(yǎng)殖天數(shù)] ×100

肝體指數(shù)（%）=（肝體重/體重）×100

（5） 腸道菌群多樣性的測定

取約0.5 g腸道內(nèi)容物與黏膜混合樣品，按照使用MP⁃bio土壤DNA提取試劑盒說明提取細(xì)菌基因組，將提取的DNA進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，并用Nanodrop對DNA的濃度和OD260 nm/OD280 nm值進(jìn)行測定。

首先針對16S rRNA基因的V3 ~ V4區(qū)設(shè)計引物，引物兩端帶有12 bp的barcode，用以識別不同樣品的序列。然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，程序如下：95 ℃預(yù)變性3 min，之后進(jìn)入擴(kuò)增循環(huán)，循環(huán)數(shù)27，循環(huán)過程為95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，最后是72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測；使用Thermo Scientific公司的GeneJET膠回收試劑盒回收產(chǎn)物；使用Illumina測序?qū)Ｓ玫腘EB NextUltraTM DNA Library Prep Kit試劑盒按照說明建立基因克隆文庫。構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit定量和檢測合格后，基于Illumina Miseq PE300平臺進(jìn)行高通量測序（上海美吉生物工程有限責(zé)任公司）。

使用Usearch (version 7.0)軟件( http://drive5.com/uparse/)，將所得序列根據(jù)97%相似度關(guān)系進(jìn)行操作分類單元(OTU)聚類分析，產(chǎn)生OTU表，并與Silva數(shù)據(jù)庫(http://www.arb⁃silva.de)比對進(jìn)行分類學(xué)分析，所用平臺為Qiime平臺(http://qiime.org/scripts/assign_taxonomy. html)，統(tǒng)計后得到各樣本的群落組成。然后對群落進(jìn)行基于OTU水平的α多樣性分析，所用軟件為Mothur(version v.1.30.1，http://www.mothur.org/wiki/Schloss_SOP#Alpha_diversity)，分析指標(biāo)包括Sobs指數(shù)、Shannon指數(shù)、Chao指數(shù)、Simpson指數(shù)、Ace指數(shù)以及覆蓋度(coverage)。腸道菌群組成分析及熱圖使用R語言工具作圖，主成分分析(PCA)采用R語言的vegan軟件包進(jìn)行分析和作圖。

（6）數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2007軟件初步整理后，使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one⁃wayANOVA)，采用Tukey法進(jìn)行平均值間的多重比較，P<0.05為差異顯著，描述性統(tǒng)計值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。

2. 結(jié)果與分析

（1）植物乳桿菌對細(xì)鱗鮭生長的影響

由表2可知，經(jīng)過56 d的養(yǎng)殖，對照組試驗魚體重為(18.23±0.45) g/尾，試驗組試驗魚體重為(19.08±0.14) g/尾，組間差異顯著(P <0.05)；試驗組的增重率在養(yǎng)殖28及56 d時均顯著高于對照組(P<0.05)。試驗組的特定生長率在養(yǎng)殖28及56 d時均顯著高于對照組(P

（2） 基于16S rRNA 基因測序的α多樣性

獲得原始序列數(shù)1228410條，經(jīng)過質(zhì)量控制，包括去除質(zhì)量值低于20的尾部堿基及含氮的堿基，根據(jù)雙端序列間的重疊關(guān)系進(jìn)行序列拼接，通過末端條形碼識別得到每個樣本的序列，最終得到優(yōu)化序列數(shù)312339條，平均序列長度為444.85bp。其中對照組獲得的有效序列數(shù)為43165條，試驗組獲得的有效序列數(shù)為58910條，2組之間差異顯著(P<0.05)(表3)。在后續(xù)分析中，為降低統(tǒng)計誤差，將每個樣本序列數(shù)抽平至37818條。

各組的覆蓋度均約等于1.00，說明了該測序結(jié)果已基本覆蓋樣本的多樣性。基于97%相似性水平劃分得到810個OTU，它們分別歸屬644個種、454個屬、213科、113目、53綱、26門。α多樣性指數(shù)包括Sobs指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Ace指數(shù)、Chao指數(shù)，對對照組和試驗組α多樣性指數(shù)的平均值進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果顯示2組之間上述指標(biāo)均存在著顯著差異(P < 0.05)(表3)。此外，Sobs指數(shù)由對照組的439降低到試驗組的196，組間差異顯著(P<0.05)(表3)，表明植物乳桿菌的添加顯著降低了樣本中所觀察到的物種數(shù)目；Shannon指數(shù)由對照組的4.0183降低到了試驗組的1. 3275，Simpson指數(shù)由對照組的0.0986升高到了試驗組的0.4029，表明對照組細(xì)鱗鮭腸道菌群多樣性較試驗組腸道高，植物乳桿菌的添加顯著降低了細(xì)鱗鮭腸道菌群多樣性；Chao指數(shù)由對照組的446.2992降低到了試驗組的249.3476，Ace指數(shù)由對照組的443.7244降低到了試驗組的251.1307，表明對照組細(xì)鱗鮭腸道菌群物種豐富度較試驗組高，植物乳桿菌的添加顯著降低了細(xì)鱗鮭腸道菌群物種豐富度。稀釋曲線(圖1)顯示，各樣本曲線均已進(jìn)入平臺期，表明測序深度可靠，能夠真實反映樣本中大多數(shù)微生物組成情況。

（3） 植物乳桿菌對細(xì)鱗鮭腸道菌群組成的影響

在門水平上，試驗組腸道菌群中，厚壁菌門的豐度達(dá)96.03%，占絕對優(yōu)勢，變形菌門的豐度為2.54%，其他門類的豐度均低于1%。對照組腸道菌群中，厚壁菌門的豐度為23.79%，相比試驗組差異顯著(P< 0.05)，藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)的豐度為23.30%，擬桿菌門(Bacteroidetes)的豐度為8.95%，螺旋菌門(Spirochaetae)的豐度為6.67%，放線菌門(Actinobacteria)的豐度為5.35%，豐度低于1%的物種的總豐度很高，達(dá)到41.28%。

在屬水平上，對照組和試驗組腸道菌群組成差別也很大。對照組中豐度在1%以上的屬有11個，豐度低于1%的屬的總豐度達(dá)41.76%，其中豐度相對較高的菌屬有未命名_藍(lán)細(xì)菌門(norank_c_Cyanobacteria)(23.30%)、勞爾氏菌屬(Ralstonia)(11.70%)、短螺旋體屬(Brevinema) (6.67%)、普氏菌屬(Prevotella)(3.90%)和乳桿菌屬(Lactobacillus)(2.89%)。而試驗組中豐度高于1%的菌屬僅有3個，以乳桿菌屬的豐度最高，占58.94%，微小桿菌屬(Exiguobacterium)占26.00%，腸球菌屬(Enterococcus)占10.62%，其他豐度低于1%的菌屬的總豐度僅占4.44%。

（4） 植物乳桿菌對細(xì)鱗鮭腸道菌群β多樣性的影響

三維PCA圖(圖4)顯示，來自試驗組和對照組的腸道菌群樣本分別聚類成2 個群體，這種聚類主要體現(xiàn)在主成分1(PC1)上，PC1坐標(biāo)軸的影響因素占總成分的73.89%。Venn圖（圖5）分析顯示，在所有樣本的1107個OTU中，共有OTU數(shù)為359個，占OTU總數(shù)的32.40%；對照組特有OTU數(shù)達(dá)到了418個，占OTU總數(shù)的37.80%；而試驗組特的OTU數(shù)為34個，僅占OTU總數(shù)的3.10%。試驗組OTU數(shù)（393個）遠(yuǎn)少于對照組（777個），使得物種豐富度降低約49.42%。

為反映細(xì)鱗鮭腸道菌群與植物乳桿菌處理的關(guān)系，進(jìn)行了熱圖構(gòu)建分析(圖6)，圖中不同的顏色代表了不同菌群的豐度，左側(cè)代表基于屬水平的菌群系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，圖中頂端代表樣品聚類關(guān)系。熱圖顯示，對照組的3個樣本彼此臨近，而試驗組的3個樣本彼此臨近，2組樣本各自聚類成1個群體，結(jié)合菌群的進(jìn)化關(guān)系，說明2組細(xì)鱗鮭腸道菌群組成差別明顯。從熱圖還可以看出，添加植物乳桿菌導(dǎo)致許多菌屬受到抑制甚至從腸道菌群中消失，如葡萄球菌屬(Staphylococcus)、桿菌屬(Geobacillus)、梭菌科-1屬(Clostridiaceae_1)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、無氧芽孢桿菌屬(Anoxybacillus)、芽孢八疊球菌屬(Sporosarcina)、副伯克氏菌屬(Paraburkholderia)、鏈球菌屬(Streptococcus)、類諾卡氏菌屬(Nocardioides)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、普氏菌屬等。此外，相比對照組，試驗組中腸球菌屬、乳桿菌屬、微小桿菌屬這3個菌屬的豐度增加明顯。與之對應(yīng)的是，Venn圖顯示多達(dá)284個OTU從試驗組中消失(圖5)，說明添加的植物乳桿菌在細(xì)鱗鮭腸道內(nèi)抑制了多種菌群的生長，改變了其菌群組成。

3. 討論

健康的腸道菌群結(jié)構(gòu)對動物多種生理機能有重要的影響，如營養(yǎng)吸收、生長發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)、疾病預(yù)防等。本研究發(fā)現(xiàn)，雖然添加植物乳桿菌未對細(xì)鱗鮭的體長產(chǎn)生顯著影響，但對細(xì)鱗鮭的體重有一定的促進(jìn)作用，在養(yǎng)殖期28和56d時均提高了特定生長率。Carnevali等使用德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)投喂歐洲鱸魚(Dicentrarchus labrax)，經(jīng)25和59 d養(yǎng)殖后，發(fā)現(xiàn)其增重率分別比對照組提高了28%和81%。Lee等用戊糖乳桿菌(Lactobacillus pentosus)飼喂日本鰻鱺(Anguilla japonica)，5周后發(fā)現(xiàn)在特定生長率、飼料轉(zhuǎn)化率及存活率方面均顯著優(yōu)于對照組。

Illumina高通量測序技術(shù)測序深度大，對菌群多樣性的反應(yīng)準(zhǔn)確、全面，在魚類腸道菌群研究中獲得了廣泛應(yīng)用。李建柱等采用高通量測序技術(shù)分析了養(yǎng)殖池塘鰱魚、鳙魚、鯽魚、草魚的腸道菌群組成，OTU數(shù)最低298個，最高412個，Shannon指數(shù)介于2. 21 ~ 3. 09。黃麗麗等在新疆額爾齊斯河流域的3種野生冷水魚（哲羅魚、細(xì)鱗鮭及黑斑狗魚）的6個樣品中共得到了58328條有效序列，OTU 數(shù)共242個。本研究中，6個樣本共獲得了有效序列數(shù)612446條，其中試驗組（58909條）有效序列數(shù)多于對照組（43164條），對照組OTU數(shù)777個，試驗組OTU數(shù)393個，且物種多樣性和豐富度方面對照組遠(yuǎn)大于試驗組，說明益生菌植物乳桿菌降低了養(yǎng)殖細(xì)鱗鮭腸道菌群多樣性，使其菌群種類向簡單化發(fā)展。

魚類腸道菌群組成受宿主種類、發(fā)育時期、環(huán)境和飼料影響而有所差異。對新疆額爾齊斯河流域野生細(xì)鱗鮭腸道菌群組成的研究發(fā)現(xiàn)，變形菌門是細(xì)鱗鮭腸道菌群中的優(yōu)勢菌門，屬水平上以嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、梭菌屬(Clostridium)等的比例較高。本研究發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖細(xì)鱗鮭腸道微生物種類豐富，優(yōu)勢菌門也是變形菌門，此外，厚壁菌門及藍(lán)細(xì)菌門的豐度也很高；在屬水平上與野生細(xì)鱗鮭差別較大，以勞爾氏菌屬、短螺旋體屬、普氏菌屬等的豐度較高。Lyons等同樣使用高通量測序技術(shù)研究了虹鱒的腸道菌群組成，發(fā)現(xiàn)γ-變形菌門占優(yōu)勢，其中腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的耶爾森氏菌屬(Yersinia)、沙雷氏菌屬(Serratia)、哈夫尼菌屬(Hafnia)和肥大桿菌屬(Obesumbacterium)等優(yōu)勢明顯。總結(jié)來說，變形菌門是冷水魚腸道菌群中常見的優(yōu)勢菌門，而在屬水平上隨著種類、養(yǎng)殖環(huán)境的變化差異更大。

本研究表明，飼料中添加植物乳桿菌使細(xì)鱗鮭腸道菌群中益生菌的豐度增加，其中乳桿菌屬的豐度由對照組的2. 89%提高到了試驗組的58.94%，增加了近20倍。此外，微小桿菌屬、腸球菌屬也占有很高的比例，它們均屬厚壁菌門的產(chǎn)乳酸菌。這些菌屬所占比例的增加使得試驗組腸道菌群中厚壁菌門的豐度達(dá)到了98%以上。微小桿菌屬能夠利用糖類發(fā)酵產(chǎn)酸，主要產(chǎn)乳酸、乙酸和甲酸，該屬很多種類被開發(fā)為益生菌，用于環(huán)境改良。腸球菌屬也是乳酸菌家族的重要成員，來自該屬的許多乳酸菌用于食品發(fā)酵及維持動物腸道健康等，特別是糞腸球菌，是該屬中最具代表性的益生菌，該菌不但可以產(chǎn)生乳酸，還可以分泌細(xì)菌素，抑制有害菌群的發(fā)展。而乳酸菌作為益生菌也被廣泛用于調(diào)控動物腸道菌群，增強宿主免疫力，抑制有害菌群，改善動物營養(yǎng)吸收、生長、發(fā)育與繁殖等。類似的研究結(jié)果也在鯽魚、羅非魚及虹鱒等魚類的腸道菌群研究中得到證實，表明植物乳桿菌對魚類腸道乳酸菌數(shù)量的提高具有顯著的效果。

物種豐富度是指群落中物種數(shù)目的多少，本試驗結(jié)果表明植物乳桿菌使細(xì)鱗鮭腸道菌群物種數(shù)目變少，在OTU水平上顯示49.42%的OTU由于植物乳桿菌的添加而從腸道菌群中消失，表明植物乳桿菌抑制了許多腸道菌群的生長，降低了細(xì)鱗鮭腸道菌群的多樣性。而這些消失的菌群很多是腸道內(nèi)有害的革蘭氏陽性菌，如葡萄球菌屬、短螺旋體屬、桿菌屬、梭菌科、芽孢桿菌屬、副伯克氏菌屬、鏈球菌屬及類諾卡氏菌屬等。植物乳桿菌對藍(lán)細(xì)菌門的抑制作用也很顯著，其豐度從對照組的23.3%降低到了試驗組的<1%。藍(lán)細(xì)菌是一類廣泛存在于環(huán)境中的古老菌群，經(jīng)常在動物腸道內(nèi)檢測到。藍(lán)細(xì)菌并非魚類腸道固有微生物，而是來自餌料攜帶或水環(huán)境。對鯽魚的研究也發(fā)現(xiàn)，益生菌在增加乳酸菌豐度的同時，顯著降低了另外一些細(xì)菌的豐度，如好氧菌及產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)。

本試驗通過在飼料中添加植物乳桿菌研究益生菌對細(xì)鱗鮭腸道菌群多樣性的影響，揭示了養(yǎng)殖模式下細(xì)鱗鮭腸道菌群的組成及其益生菌調(diào)控效應(yīng)，為今后在魚類腸道微生物菌群調(diào)控技術(shù)方面以及在腸道微生物層面上研究冷水魚營養(yǎng)與生長、免疫與疾病等提供參考。

4． 結(jié)論

① 飼料中添加植物乳桿菌可以顯著提高細(xì)鱗鮭的特定生長率。

② 養(yǎng)殖細(xì)鱗鮭腸道菌群在門水平上以變形菌門、厚壁菌門和藍(lán)細(xì)菌門為主；在屬水平上分布較均勻，勞爾氏菌屬、短螺旋體屬、普氏菌屬的豐度較高但未形成優(yōu)勢菌屬，菌屬種類繁多且豐度都較低。

③ 飼料中添加植物乳桿菌顯著改變了細(xì)鱗鮭腸道菌群組成，在門水平上厚壁菌門占絕對優(yōu)勢，在屬水平上乳桿菌屬占優(yōu)勢，未命名＿藍(lán)細(xì)菌門豐度明顯下降。　　

④ 綜合認(rèn)為，飼料中添加植物乳桿菌可使細(xì)鱗鮭腸道菌群物種多樣性和豐富度降低，益生菌豐度增加，并可促進(jìn)細(xì)鱗魚生長。

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