高溫固態(tài)發(fā)酵制備豆粕多肽飼料中試試驗探究
摘要：研究運用自主開發(fā)的一套高溫發(fā)酵技術，采用實驗室篩選馴化的一株優(yōu)良高溫芽孢桿菌，配合自主研制的滾筒固態(tài)發(fā)酵設備，將800kg左右的豆粕與發(fā)酵種子液混合進行高溫(55℃左右)固態(tài)發(fā)酵中試試驗。結果表明:在發(fā)酵15h左右高溫發(fā)酵豆粕多肽含量提高近1倍，發(fā)酵52h時粗蛋白含量提高5.90%，發(fā)酵后豆粕的尿素酶活性明顯降低16種氨基酸的含量均有不同程度的升高。試驗證明使用該高溫固態(tài)發(fā)酵技術與滾筒固態(tài)發(fā)酵設備進行發(fā)酵豆粕工業(yè)化生產(chǎn)具有可行性與潛力。
豆粕是大豆提油后的副產(chǎn)品，豆粕中存在多種抗營養(yǎng)因子，影響機體對營養(yǎng)的吸收。在微生物發(fā)酵過程中，微生物能產(chǎn)生水解酶消除豆粕中的抗營養(yǎng)因子，且能提高豆粕內多肽含量，提高動物消化吸收水平;此外，微生物發(fā)酵產(chǎn)生的益生菌對動物腸道改善、降低抗生素使用等方面均有顯著效果。因此，對豆粕進行微生物發(fā)酵制備發(fā)酵豆粕成為近些年飼料行業(yè)研究的熱點，固態(tài)發(fā)酵是目前生產(chǎn)發(fā)酵豆粕的主要方式。在實際生產(chǎn)中，一般將制備的發(fā)酵劑通過常規(guī)飼料混合裝置與發(fā)酵物料、培養(yǎng)基、水等輔料進行混合，保持發(fā)酵所需條件進行發(fā)酵，但該發(fā)酵過程消耗大量能量。現(xiàn)代固態(tài)發(fā)酵一般是中低溫發(fā)酵，發(fā)酵溫度一般在36℃左右，但在這個溫度范圍豆粕自帶的原生菌也會隨著生長，影響整個發(fā)酵效果，而且大批量固態(tài)發(fā)酵設備發(fā)展相對滯后，發(fā)酵設備需要進一步升級才能與發(fā)酵工藝技術相匹配。本文的中試試驗選用高溫菌株進行發(fā)酵，發(fā)酵溫度50～65℃，在發(fā)酵過程中可抑制部分中低溫原生菌的生長，減少干擾，達到更好的發(fā)酵效果。該固態(tài)發(fā)酵技術原料跳過滅菌步驟，可以節(jié)省成本與能耗，配合自主研制的中試發(fā)酵設備，可方便而快捷地實施豆粕固態(tài)發(fā)酵，為高溫菌株進行豆粕高溫固態(tài)發(fā)酵優(yōu)化、實現(xiàn)工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)提供實際參考。
1 材料與方法
1.1 試驗材料
發(fā)酵菌株(高溫芽孢桿菌)，實驗室篩選;豆粕，中儲糧鎮(zhèn)江糧油有限公司。
培養(yǎng)基:胰蛋白胨1.5%、大豆蛋白胨0.5%、氯化鈉0.5%。氫氧化鈉、碳酸鈉、酒石酸鉀及硫酸銅，分析純，購于國藥集團。
高壓滅菌鍋，上海博迅實業(yè)有限公司;
超凈工作臺，上海博迅實驗有限公司醫(yī)療設備廠;
數(shù)顯氣浴恒溫振蕩器，常州普天儀器制造有限公司;
300L液體發(fā)酵罐，常州新區(qū)三環(huán)生物工程成套設備有限公司;
滾筒固態(tài)發(fā)酵罐，自主研制;
凱氏定氮儀，丹麥FOSS公司;氨基酸自動分析儀，日立儀器(上海)有限公司;
高效液相色譜儀，美國Waters公司。
1.2 試驗方法
1.2.1 基礎種子液制備
超凈工作臺預先殺菌30min，關閉紫外燈后，在酒精燈下分別挑取1環(huán)高溫菌株接入7瓶300mL無菌培養(yǎng)基中，于55℃搖床中活化培養(yǎng)14～18h，制得一級發(fā)酵種子液。
1.2.2 中試發(fā)酵種子液制備
300L液體發(fā)酵罐經(jīng)空消后，加入200L無菌液體培養(yǎng)基，再倒入1.2.1制得的7瓶一級發(fā)酵種子液(2100mL)，(55±0.5)℃發(fā)酵14～18h，得到二級發(fā)酵種子液。
1.2.3 混合菌液制備
將制備的二級發(fā)酵種子液加入提前加熱到70℃的800L熱水中，制得約1000L的混合菌液。
1.2.4 豆粕與發(fā)酵液的混合發(fā)酵
按照豆粕與混合菌液質量比1∶1.25計算，加入豆粕量800kg左右。將混合菌液和豆粕按一定的進料速度同時加至滾筒固態(tài)發(fā)酵罐(簡稱發(fā)酵滾筒)中，混合料溫度在 55℃左右，待物料全部加入到滾筒內，開啟加熱，每隔30min旋轉兩周，進行固態(tài)發(fā)酵。
1.2.5 豆粕發(fā)酵過程中溫度變化監(jiān)測
根據(jù)發(fā)酵滾筒中部及尾部卸料口處設置的兩個實時溫濕度傳感器記錄溫度變化。
1.2.6 樣品干燥
從料液完全進入發(fā)酵滾筒開始計時，約每4h取樣2kg，將所取樣品放入65℃烘箱內烘干，粉碎待測。
1.2.7 樣品檢測
粗蛋白測定采用GB/T 6432—2018中的方法;粗纖維測定采用GB/T 6434—2006的方法;粗灰分測定采用GB/T 6438—2007的方法;KOH蛋白質溶解度測定采用GB/T 19541—2017的方法;胰蛋白酶抑制因子的測定采用ELISA方法;尿素酶活性測定采用GB/T 8622—2006的方法;氨基酸的測定采用GB/T 18246—2000的方法;有機酸含量的測定采用GB/T 23877—2009的方法。多肽含量檢測:取2.5g粉碎后的豆粕加入蒸餾水，定容至100mL，攪拌30min后4000r/min離心15min。用蒸餾水將離心后的原液稀釋至合適倍數(shù)，取2mL混入等體積10%三氯乙酸溶液，混勻后靜置10min，于10000r/min離心10min。取1mL上清液與5mL堿性銅試劑混勻后快速加入0.5mL福林酚試劑，于30℃下保溫30min，于680nm下測定吸光值，按照標準曲線方程y=0.0024x+0.0307(R2=0.9981)，計算多肽含量。
1.2.8 數(shù)據(jù)分析
檢測數(shù)據(jù)通過SPSS19.0軟件進行顯著性分析，采用單因素方差分析檢驗組間差異顯著性，采用Duncan 法進行多重比較，顯著性水平為P＜0.05，并用 Origin 8.0進行作圖。
2 結果與分析
2.1 發(fā)酵滾筒中部及卸料口溫度變化(見圖1)
所研制設備加熱方式是以翅片式加熱管通入高壓蒸汽進行加熱，以熱風機將滾筒前部熱空氣吹到后部進行加熱。發(fā)酵滾筒長度為9m，直徑為2m，翅片式加熱管長度為3m，在加熱過程中會造成發(fā)酵滾筒內局部受熱不均的現(xiàn)象，特別是尾部卸料口的溫度一直低于前、中部溫度。由圖1可見:固定蒸汽通入量，在0～15h發(fā)酵滾筒中部溫度一直處于不斷增長的趨勢，可能是物料發(fā)酵過程產(chǎn)生的熱量使溫度上升和外來熱源加熱共同作用結果;發(fā)酵15～40h滾筒中部溫度基本在50～60℃區(qū)間內，發(fā)酵45h以后溫度又開始上升，此時高溫發(fā)酵菌種活力變弱，可能是其他雜菌變成優(yōu)勢菌種開始生長產(chǎn)生熱量。卸料口溫度變化趨勢與滾筒中部溫度整體相似。
2.2 高溫固態(tài)發(fā)酵對豆粕中粗蛋白、粗灰分、粗纖維含量變化的影響(見圖2)
由圖2可知:豆粕發(fā)酵后其粗蛋白含量隨著發(fā)酵時間的延長呈增長趨勢，未發(fā)酵時粗蛋白含量為50.55%，發(fā)酵52h粗蛋白含量增長到53.53%，增長率達5.90%，原因一是高溫菌株在發(fā)酵過程中，利用發(fā)酵種子液中的培養(yǎng)基，產(chǎn)生一些菌絲蛋白，二是物料中部分有機物在發(fā)酵過程中以無機氣體的形式揮發(fā)，使得干基粗蛋白含量相對上升;發(fā)酵后豆粕中粗纖維含量明顯下降，發(fā)酵15h時其含量由未發(fā)酵前的10%降低到4.53%，說明該高溫菌株對粗纖維有一定的分解作用;發(fā)酵前后豆粕中粗灰分含量保持在7%～8%，變化范圍不大。
2.3 高溫固態(tài)發(fā)酵對豆粕 KOH 蛋白質溶解度變化的影響(見圖3)
由圖3可知，發(fā)酵15h時豆粕受溫度影響，KOH蛋白質溶解度從82%降低到 61%，蛋白質隨著發(fā)酵時間的延長發(fā)生變性，但隨后發(fā)酵時間延長到25h時 KOH 蛋白質溶解度恢復到83.1%，發(fā)酵時間到52h時 KOH 蛋白質溶解度又逐漸降低到77%左右，可能該高溫發(fā)酵菌種對蛋白質的變性程度有一定的改善作用。
2.4 高溫固態(tài)發(fā)酵對豆粕胰蛋白酶抑制因子變化的影響(見圖4)
一般認為胰蛋白酶抑制因子含量和尿素酶含量呈正相關關系，且豆粕中胰蛋白酶抑制因子和尿素酶活性含量變化的程度是一致的。由圖4可知，發(fā)酵后豆粕中胰蛋白酶抑制因子含量變化不顯著。
2.5 高溫固態(tài)發(fā)酵對豆粕尿素酶活性變化的影響(見圖5)
由圖5可知，尿素酶活性隨豆粕高溫發(fā)酵時間的延長逐漸顯著降低，從0.03U/g降低到0.002U/g左右。尿素酶活性變化比胰蛋白酶抑制因子的變化明顯，且胰蛋白酶抑制因子含量的測定方法比較煩瑣，建議用尿素酶活性表征豆粕的抗營養(yǎng)因子。高溫固態(tài)發(fā)酵確實對豆粕抗營養(yǎng)因子有顯著的降低作用。
2.6 高溫固態(tài)發(fā)酵對豆粕中有機酸含量變化的影響(見圖6)
豆粕經(jīng)高溫發(fā)酵后能產(chǎn)生多種有機酸，其中乳酸含量最高。由圖6可知，乳酸含量隨發(fā)酵時間延長不斷增加，豆粕發(fā)酵52h時乳酸含量可達4.49g/kg，且有持續(xù)上漲趨勢，低于實驗室小規(guī)模發(fā)酵試驗的(22.58g/kg)。本中試規(guī)模發(fā)酵與實驗室發(fā)酵所制造的環(huán)境條件存在差異，尚不能達到此含量，但是在增大發(fā)酵物料、減少發(fā)酵空間的條件下，實施二次優(yōu)化中試試驗時，豆粕乳酸含量可以提高到15.69g/kg。
2.7 高溫固態(tài)發(fā)酵對豆粕多肽含量變化的影響(見圖7)
由圖7可知，采用發(fā)酵滾筒在高溫發(fā)酵菌種的作用下，豆粕多肽含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，發(fā)酵15h豆粕多肽含量從27.14mg/g增加到50.61mg/g，多肽含量最高可提高近1倍。這可能是因為發(fā)酵過程中微生物分泌的蛋白酶分解大分子蛋白質，蛋白質被分解后生成小分子多肽。隨著發(fā)酵時間的持續(xù)延長，多肽含量呈現(xiàn)降低趨勢，原因可能是發(fā)酵后期雜菌逐漸成為優(yōu)勢菌株，部分不明雜菌分解掉部分肽，所以合理控制發(fā)酵時間是重要一環(huán)。該中試發(fā)酵豆粕產(chǎn)品中多肽含量低于實驗室含量，因為該高溫發(fā)酵的最佳發(fā)酵溫度在55℃左右，目前該設備對溫度控制的穩(wěn)定性還有所欠缺，主要是發(fā)酵滾筒內局部溫度不均勻(見圖1)，所以本試驗控制發(fā)酵溫度是關鍵因素。
2.8 高溫固態(tài)發(fā)酵對豆粕中16種氨基酸含量變化的影響
不同發(fā)酵時間下豆粕中氨基酸含量變化情況如表1所示。
由表1可知，經(jīng)高溫發(fā)酵后豆粕中16種氨基酸含量基本均高于未發(fā)酵前豆粕中氨基酸的含量，發(fā)酵25h左右氨基酸含量較高。該中試發(fā)酵豆粕的氨基酸含量低于實驗室的。
3 結論
采用特制發(fā)酵罐結合開發(fā)的高溫固態(tài)發(fā)酵技術制得的高溫發(fā)酵豆粕多肽含量在發(fā)酵15h左右提高近1倍，發(fā)酵52h時豆粕中粗蛋白含量可提高5.90%，經(jīng)發(fā)酵后的豆粕尿素酶活性明顯降低，16種氨基酸含量均有不同程度的升高;對比NY/T 2218—2012《飼料原料發(fā)酵豆粕》，本方法制備的發(fā)酵豆粕粗蛋白、粗纖維、粗灰分、尿素酶活性均達到標準要求，在發(fā)酵15h時滿足賴氨酸含量不低于2.5%的要求。
該中試試驗發(fā)酵豆粕中多肽含量、有機酸含量及氨基酸含量低于實驗室的，中試規(guī)模試驗未達到最佳發(fā)酵效果，主要原因是設備自身還存在不足，導致固態(tài)發(fā)酵溫度無法穩(wěn)定滿足最佳發(fā)酵溫度55℃左右，需要進一步改進發(fā)酵設備的加熱保溫自動化精確控制與發(fā)酵中后期酶活力不足的問題;而且在樣品干燥過程中豆粕可能會進行二次發(fā)酵，干燥過程中變化也還需進一步研究;整體上中試試驗證明，該高溫固態(tài)發(fā)酵技術配合自主研發(fā)的發(fā)酵設備在進行非滅菌工藝發(fā)酵豆粕的擴大生產(chǎn)上具有較高的可行性，發(fā)酵豆粕中多肽含量、粗蛋白含量、有機酸含量、氨基酸含量及 KOH 蛋白質溶解度均有顯著性提高，尿素酶活性明顯降低;其耗氧發(fā)酵和非滅菌的發(fā)酵方式便捷且節(jié)能，有較大應用潛力。
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