近年來，利用微生物發酵技術來開發新型飼料資源越來越受到人們的重視。通過微生物發酵，可使飼料或者飼用原料中含有更多的活性益生菌菌體、各種消化酶及代謝產物、蛋白質分解產物及活性小肽、抑菌物質，同時使飼料中的抗營養因子含量降低，起到促進生長、維持動物健康的作用。

常用的微生物發酵菌種主要是乳酸菌、酵母菌、芽孢桿菌和霉菌。乳酸菌發酵飼料可以降低仔豬胃內的酸度，增加仔豬的采食量，從而提高其生產性能，同時，能有效抑制有害細菌的生長和繁殖，控制仔豬的腹瀉，減少抗生素的使用，具有良好的生產和應用價值；酵母菌富含蛋白質、氨基酸（粗蛋白質含量高達50%）及多種維生素，同時含有多種動物所需的消化酶（α-淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、半纖維素酶等）和其他代謝產物，在提高動物的免疫、生長和繁殖能力方面具有顯著功效，是天然綠色生物飼料添加劑，價格低廉并有很高的經濟價值，市場需求旺盛，具有很好的應用前景；酸溶蛋白即分子質量較低的蛋白水解物，包括肽和游離氨基酸，使用酸溶蛋白含量指標評價發酵酶解粕類蛋白質品質，既可以反映其中抗原蛋白質和其他蛋白質抗營養因子被水解的程度，進而揭示該類抗營養因子活性被消除的程度，又可一定程度上反映肽含量的高低，表明畜禽生長必需氨基酸含量增加，發酵飼料中氨基酸組成在向優質化方向轉化。

目前，國內外對微生物發酵飼料在畜禽飼養中的應用和理論研究較多。但國內外對發酵飼料的研究主要集中在發酵菌株類型、生理功能、飼喂效果上，對影響發酵飼料品質的發酵方式、生產工藝條件、發酵眾多代謝物質的活性成分分析等研究相對較少，對發酵飼料眾多代謝產物的有效成分缺乏較深入的研究。本試驗旨在研究適宜哺乳母豬全價飼料發酵的乳桿菌和酵母菌的篩選和復配發酵方式對發酵飼料pH、活菌數、總酸含量、粗蛋白和酸溶蛋白含量的影響，為乳桿菌和酵母菌發酵全價飼料提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 發酵基料和菌株

玉米豆粕型配合飼料：山東某飼料有限公司。

6株乳桿菌菌株（BLCC2-0001、BLCC2-0015、BLCC2-0038、BLCC2-0092、BLCC2-0111、BLCC2-0114；4株酵母菌菌株（BLCC4-0048、BLCC4-0021、BLCC4-0044、BLCC4-0042）：由山東某生物工程股份有限公司研究院保存。

1.1.2 培養基

MRS培養基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏8g/L，酵母膏4g/L，硫酸鎂0.5g/L，硫酸錳0.3g/L，檸檬酸銨2g/L，乙酸鈉5g/L，吐溫-801mL/L，pH值6.0，121℃滅菌20min。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏0.5g/L，磷酸二氫鉀2.0g/L，pH自然，121℃滅菌20min。

1.1.3 化學試劑

葡萄糖：山東某藥業有限公司；

蛋白胨：北京某生物技術有限責任公司；

牛肉膏、酵母膏：天津市某生化試劑有限公司；

硫酸鎂、硫酸錳：濟南某化工有限公司；

檸檬酸銨：上海某有限公司；

乙酸鈉：青島某生物科技有限公司；

吐溫-80、氫氧化鈉：天津某化學試劑有限公司；

磷酸二氫鉀：天津市某化學試劑有限公司；

氯化鈉：天津某化工股份有限公司；

LBS瓊脂培養基、孟加拉紅培養基：青島某有限公司。

所用實驗試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

DHP-9082電熱恒溫培養箱：上海某科技有限公司；

THZ-C恒溫振蕩器：揚州某實驗儀器有限公司；

HH-4數顯恒溫水浴鍋：某電器有限公司；

KDN-103F自動定氮儀、HYP-1008八孔消化爐：上海某儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 酵母菌和乳桿菌發酵液的制備

將4℃條件下保存的酵母斜面活化，轉接到裝有50mL YEPD培養基的三角瓶中，30℃搖床振蕩培養16h備用；將4℃條件下保存的乳桿菌斜面活化，轉接到裝有100mL MRS培養基的鹽水瓶中，37℃培養箱靜置培養24h備用。

1.3.2 試驗設計

（1）乳桿菌的篩選

稱取一定量的基料按料水比1∶0.4（g∶mL），以裝袋量為100g/袋裝袋，每個樣品設3個平行，分別按照2%接種量接入培養好的乳桿菌發酵液，以不接種任何菌株的空白料為對照，壓實后于37℃培養箱進行生料厭氧發酵，分別于發酵24h、48h和72h取樣，測定pH值、活菌數和總酸含量。

（2）酵母菌的篩選

稱取一定量的基料于500mL三角瓶中，料水比為1∶0.4（g∶mL），裝量50g/瓶，按2%接種量分別接入培養好的酵母菌種子液，每個樣品設3個平行，以不接種任何菌株的空白料為對照，置于30℃培養箱進行需氧發酵，分別于發酵24h、48h和72h取樣，測定活菌數和粗蛋白含量。

（3）混菌發酵

將上述篩選得到的乳桿菌和酵母菌進行混菌發酵，發酵方式為厭氧發酵，料水比為1∶0.4（g∶mL），以裝袋量為100g/袋裝袋，接種量2%，乳桿菌:酵母菌（3∶2），生料發酵，30℃培養箱培養。以不接種任何菌株的空白料為對照，分別于發酵24h、48h和72h取樣，測定pH值、活菌數、總酸、粗蛋白和酸溶蛋白含量。

1.3.3 測定方法

pH測定：取10g樣品加入90mL滅菌后的生理鹽水中，攪拌均勻后直接測定。

乳桿菌和酵母菌活菌數的測定：準確稱取發酵飼料10.0g，用生理鹽水10倍遞增稀釋，取適當稀釋度的樣品分別至LBS培養基和孟加拉紅培養基中，分別于37℃和30℃培養48h，根據菌落數計算樣品中乳桿菌和酵母菌數量，結果用CFU/g表示。

總酸含量的測定：參照國標GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》中的酸堿滴定法測定。粗蛋白含量：參照國標GB/T 6432—1994《飼料中粗蛋白測定方法》測定。

酸溶蛋白含量：參照QB/T 2653—2004《大豆肽粉》中酸溶蛋白質含量的測定。準確稱取樣品2.00g，加入15%三氯乙酸溶液25mL，混合均勻，靜置30 min。將溶液定量轉移，在4000 r/min條件下離心10min后，取全部上清液，以下按照上述粗蛋白的測定方法。結果為占粗蛋白的百分含量。

2 結果與分析

2.1 乳桿菌發酵對飼料品質的影響

乳桿菌發酵對飼料品質的影響見表1。