生態養殖床芽孢桿菌和酵母菌篩選培育試驗
導讀
隨著養殖產業的大規模發展，大量增加的豬場糞便等對自然界已經造成嚴重污染，如果不立即采取措施，將會制約養殖業的可持續發展。以前的集約化和工廠化養殖已不能更有效地滿足人類需求，而推廣的生態養殖床養殖技術，是實現養殖業又好又快發展的重要措施。
至上世紀90 年代開始，為使豬肉的品質和生產性能有大的提高，中外學者對生態發酵床養豬技術做了很多的研究 。目前我國農村也大力提倡生態發酵床養殖技術，即將多種類的有益微生物比如酵母菌、放線菌、枯草芽孢桿菌等按照比例同木屑及輔助材料混合發酵，然后將形成的有機墊料鋪墊在養殖圈中，當動物排泄的糞便被有機墊料吸收后，墊料中的微生物會迅速降解其中的微生物，從而達到無臭味和無害化的目的。
將生態發酵床養殖與集約化、工廠化養殖相比較后得出，生態發酵床養殖技術遵循畜禽在自然環境下按照自身原來的生長發育規律生長，而非人為地制造生長環境讓畜禽違反自身原有的生長規律快速生長。發展生態發酵床養殖技術對于改善人們的生活質量和滿足市場需求等都有非常重要的意義，并且能最大限度地節約自然資源，在生產無公害綠色和有機食品方面有較大的應用前景。
生態發酵養殖床中含有復合菌類，本文對其中的細菌進行研究，鑒定其屬于那個菌種 。根據各種菌的培養特性，對各種營養成分的分解能力研究制作發酵床所需要的條件，使生態養殖床發酵技術有更好的發展前景。
1材料與方法
1.1 實驗材料
1.1.1 試劑及藥品
革蘭染色試劑，甲基紅試劑，吲哚試劑，過氧化氫，淀粉，明膠，碘，蒸餾水等 。
1.1.2 儀器及器材
AB204 － S 電子分析天平，HH － S6 數顯恒溫水浴鍋，ＲAYW － 16 無菌涂布器，佩特里氏 630125 培養皿，YNK － 03 － 00 鎳洛合金接種環，DW － 9 型自動培養基分裝器，DYML － S30C 高壓蒸汽滅菌鍋，p H240 恒溫培養箱，LWK500LT 光學顯微鏡，DFT － 200 小型高速粉碎機 等 。
1.2 芽孢桿菌的培育篩選
1.2.1 材料來源
用于分離菌種的樣品采自蘭州市榆中縣夏官營鎮地表層的土壤 。用已滅菌的鏟子取土壤表層 10cm 下的土樣，將采得的樣品土壤放入已滅菌的紙袋里，帶回實驗室進行菌種的分離 。
1.2.2 方法
1.2.2.1 稀釋涂布平板法分離
將采集的 10 g 土樣加入到有 90 m L 蒸餾水的有玻璃珠的三角瓶中，緩慢晃動三角瓶使其中的土粒混勻，然后靜置，吸取其中的上清液 1 m L 到無菌的試管中 。然后加入蒸餾水配制成 10－ 2濃度的懸液，再依次稀釋成 10－ 3、10－ 4、10－ 5濃度的懸液，將此四個梯度各取 0.2 m L 加到p H 為 10 的營養瓊脂培養皿中，使用無菌的玻璃棒進行涂布，然后放入 37 ℃ 的恒溫箱中培養 2 ～ 3 d。
1.2.2.2 菌株的篩選
分別挑取菌落從上述平板上分離的部分菌體，在營養瓊脂平板上劃線進行分化，重復多次挑取篩選就可得到該菌株的純種菌種 。將采用此法得到的該菌的 6 株菌分別標號為 1、2、3、4、5、6 號菌株。
1.2.3 芽孢桿菌菌種的鑒定
1.2.3.1 形態特征
個體形態: 菌體經過革蘭氏染色后在光學顯微鏡下觀察細菌的形狀并測定其大小; 用芽孢染色法在光鏡下觀察芽孢的形狀、著生位置等 。
群體形態觀察: 將 1 ～ 6 號菌株分別劃線接種于營養瓊脂平板上，37 ℃ 培養 2 ～ 3 d，于營養培養基上接一環菌懸液涂勻后，37 ℃培養 24 h、48 h，分別革蘭染色觀察結果。
1.2.3.2 生化試驗
使用革蘭氏染色顯示陽性的菌株進行糖發酵試驗、甲基紅試驗、吲哚試驗、明膠試驗、淀粉試驗、過氧化氫酶試驗來確定最終篩選的菌株的類型。
1.3 酵母菌的分離篩選
1.3.1 材料
在附近超市購買發酵傳統面粉的發酵劑 。
1.3.2 方法
1.3.2.1 酵母菌增菌培養
用天平稱取 2 g 樣品，在無菌條件下加至 p H 值為 4.0 的麥芽汁瓊脂培養基中，30 ℃ 下培養 48 h。
1.3.2.2 酵母菌的分離與篩選
采用劃線法將上述酵母菌增菌液接種到pH為 4 的麥芽汁瓊脂板上，然后 30 ℃條件下培養 24 h，再從中挑出單個菌落接種到麥氏固體培養基的斜面上，培養結束后將待鑒定的菌株置于 4 ℃的冰箱中。
1.3.3 酵母菌菌種的鑒定
1.3.3.1 形態及菌落特征觀察
將待鑒定的菌株接種于麥芽汁固體培養基，30 ℃ 條件下培養 3 d 后觀察。
1.3.3.2 生化試驗
1.3.3.2.1 糖發酵試驗
在培養皿中分別加入糖發酵基礎培養基，然后滅菌加入 10% 的糖液，并使糖濃度達到 2%，篩選編號為 A、B、C、D、E 的菌株接種到 30 ℃的培養基中倒置培養，培養 7 d 后判定結果。
1.3.3.2.2 不同 p H 值對酵母菌生長的影響
將酵母菌接種到 p H 分別為 4.0，5.2，6.4 的麥芽汁固體培養基上，在 30 ℃ 條件下培養 3 d，并且定期測量觀察菌落的大小。
1.3.3.2.3 不同溫度對酵母菌生長的影響
將培育篩選的菌株分別在 37 ℃和 30 ℃條件下培養，定時觀察形態和測量菌落大小。
2結果與分析
2.1 芽孢桿菌的鑒定
2.1.1 形態特征
在營養瓊脂平板上，菌落粗糙半透明，灰白色或乳白色( 如圖1) ，再通過革蘭氏染色鏡觀察芽孢桿狀呈革蘭陽性，菌端呈鈍圓或平 。每個細胞只有一個芽孢，單個或鏈狀排列，無莢膜以周鞭毛運動，芽孢囊不明顯膨大( 如圖2) 。
2.1.2 生化特征鑒定
2.1.2.1 芽孢桿菌生化試驗的分析( 見表1)
本試驗對土壤中分離得到的6株芽孢桿菌進行屬的鑒定，結果見表1。由表 1 可以看出，革蘭氏染色試驗和甲基紅試驗、過氧化氫試驗、吲哚試驗、淀粉試驗和明膠試驗均為陽性。根據形態特征和常規的生化鑒定結果將分離出的6株菌株確定為芽孢桿菌 。
2.1.2.2 芽孢桿菌糖發酵特性的鑒定( 見表 2)
將分離到的 5 株芽孢桿菌屬的菌株，進一步做糖發酵試驗，結果如表 2 所示。由表 2 可知 5 株菌是同一種菌種，鑒定為芽孢桿菌。
2.2 酵母菌的鑒定
2.2.1 細胞形態及培養特征觀察結果
培養基菌落大而且厚，呈乳白色、土黃色，圓形，表面光滑濕潤，黏稠且扁平，邊緣整齊( 如圖 3) 。革蘭氏染色鏡檢觀察細胞呈圓形 。培養過程中呈多樣性，增殖方式為芽殖，且為一端芽殖，細胞核清晰，細胞間無雜質碎片( 如圖 4) 。
2.2.2 生化試驗結果
2.2.2.1 糖發酵試驗結果
2.2.2.2 不同 p H 值對酵母菌生長的影響
從表 4 可以看出，p H 值為 4. 0 時酵母菌在 24 h 內基本沒有生長 。從培養 3 d 的生長總體結果看，p H 值為 5. 2 時比 p H 值為 4. 0 和 6. 4 時的各階段菌株的生長情況更好些 。
2.2.2.3 不同溫度對酵母菌生長的影響
從表 5 可以統計出，相同時間內 37 ℃條件下酵母菌的生長速度比 30 ℃時生長速度快。
3討論
3.1 芽孢桿菌和酵母菌的討論
芽孢桿菌生長溫度范圍在 15 ～ 40 ℃，其中最適生長溫度為 30 ～ 37 ℃，最適 p H 范圍為 7.2 ～ 7.4，它的營養要求不高，在普通瓊脂培養基中就可生長，培養 24 h 就能看見灰白色表面干燥邊緣粗糙的菌落并且形成芽孢 。雖然在普通培養基中不形成莢膜，但是在血清瓊脂或者碳酸氫鈉瓊脂上，于 10% ～20% 的CO2條件下培養就可以形成莢膜 。因此，生態養殖中其內含有芽孢桿菌可以分解纖維素等，這樣就不需要清除圈內家畜的糞便，可自動分解且不污染環境，再者豬還可以啃吃發酵床墊料，減少飼料的耗量，也可以提高飼料消化率 。
酵母菌含有豐富的蛋白質，可以幫助消化，在生長過程中可以形成多種 B 族維生素，這有助于其他微生物和動物的吸收和生長 。它含有超氧化物歧化酶( SOD)。SOD 是動物體內銅、鋅、鐵、錳的氧化酶，可以消除動物體內氧的自由基，解除游離氧對 O2-的毒性作用 。所以生態養殖中，發酵床含有酵母菌，在動物啃吃了墊料后，體內酵母菌增加，對機體有益，可以更好的生長 。另外，酸化培養基一般用磷酸或鹽酸，因為有機酸在 pH 值為 3.5 ～ 4.0 時僅有部分能解離，對多數酵母菌而言大量未解離的酸是有害的 。
酵母菌通常接種在液體培養基中，通過測定培養液的混濁度來研究酵母菌的生長狀況 。本文分離的菌株將用于生態養殖發酵床的研究，因此試驗設計利用固體平板培養基測定酵母菌在不同溫度和不同 pH 值條件下的生長狀況，得到的試驗數據為發酵床研究奠定了良好的基礎 。
3.2 生態養殖床前景探討
生態養殖床的養豬模式，因豬糞便被有機墊料消化分解，從而沒有廢棄物排出養豬場，減輕了對環境的污染，并且節約了清潔用水，豬在生態養殖床墊料上采食菌體蛋白，抗病能力明顯增強了。生態養殖床中的微生物活動非常的活躍，伴隨著熱量的大量排放，在冬季低溫時節，生態養殖床表面的溫度可以達到 25 ℃，并且因其質地松軟，成為豬喜愛活動和休息的場所，但是如果到高溫季節時，生態養殖床設計不當則會造成溫度過高而影響豬生長，所以生態養殖床的設計是十分重要的。生態養殖床的墊料除了要防止水分過大外，同時還需防止墊料過干而起塵，這個需要以豬走動不起塵土為準，生態養殖床舍還要注意通風，屋頂不低于 3.5 m，并且窗戶齊全，還需要有隔熱保溫層。豬生態養殖床養殖是一種新的飼養模式，在生產管理中隨時都會出現新的問題，管理者必須及時發現問題、解決問題，才能更好地利用微生態養殖，獲得良好的經濟效益。
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