對(duì)全國(guó)養(yǎng)殖業(yè)與飼料業(yè)而言，2020年是極其特殊又極具挑戰(zhàn)的一年。從年初非洲豬瘟的大面積爆發(fā)到農(nóng)業(yè)農(nóng)村部7月份明令叫停飼料企業(yè)對(duì)抗生素的生產(chǎn)和使用，這些現(xiàn)實(shí)與困難迫使人們從飼料配方到養(yǎng)殖模式都急需找到能替代抗生素的產(chǎn)品與技術(shù)。在此大背景下，人們把研究方向和重點(diǎn)轉(zhuǎn)向發(fā)酵飼料的優(yōu)化升級(jí)，以此替代抗生素在飼料中的作用。對(duì)抗生素的依賴主要因其可通過(guò)抑止有害微生物的繁殖，進(jìn)而維持動(dòng)物機(jī)體健康，提高消化吸收利用率。發(fā)酵飼料正是通過(guò)菌酶協(xié)同等方式與致病菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)進(jìn)而抑止有害微生物在動(dòng)物體內(nèi)定植，起到抗菌、防病的功能，還可調(diào)節(jié)機(jī)體腸道菌群平衡，改善腸道環(huán)境。

發(fā)酵飼料又稱(chēng)微生物發(fā)酵飼料。可見(jiàn)，微生物在發(fā)酵飼料中起到至關(guān)重要的作用，菌種的選擇是發(fā)酵飼料品質(zhì)的前提與關(guān)鍵。發(fā)酵飼料的優(yōu)化從根本也是菌種的性能篩選與合理配伍。我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部在《飼料添加劑品種目錄》中規(guī)定在飼料中可用的微生物菌株達(dá)30余種。目前。發(fā)酵飼料使用的菌種主要以酵母菌、乳酸菌、芽孢桿菌為主。文章研究在發(fā)酵飼料常用菌中篩選出抑制以金黃色葡萄球菌與大腸桿菌為代表的致病菌性能較強(qiáng)的菌株，進(jìn)而用篩選出的菌株優(yōu)化提高發(fā)酵飼料的抑菌性能。近年來(lái)，許多學(xué)者對(duì)發(fā)酵菌種的單菌菌液抑菌能力評(píng)估深入研究，而對(duì)發(fā)酵飼料本身的抑菌性能評(píng)估方法及研究鮮少涉及。文章在采用瓊脂擴(kuò)散牛津杯法評(píng)估發(fā)酵飼料的體外抑菌性能的基礎(chǔ)上優(yōu)化測(cè)定方法，充分提取發(fā)酵飼料本身的抑菌物質(zhì)，更大程度上體現(xiàn)出發(fā)酵飼料的抑菌性能，供廣大學(xué)者和飼料企業(yè)參考與使用。

1.材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)菌種

乳酸菌（1×1010CFU/g）：L1、L2、L3;芽孢桿菌（1×1011CFU/g）：K1、K3、K9、D1、D3、D9、Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6，以上菌種均為公司實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

1.1.2 指示菌

金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus,S.a）ATCC26003、大腸桿菌（Escherichiacoli,E.coli）ATCC44102。

1.1.3 培養(yǎng)基及試劑

液體培養(yǎng)基：MRS液體培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基。平板培養(yǎng)基：LB固體培養(yǎng)基。

1.1.4 器皿及用品

三角瓶、直徑（90±0.1）mm的培養(yǎng)皿、1mL移液槍、100μL移液槍、內(nèi)徑 （6±0.1）mm的牛津杯、鑷子、無(wú)菌棉棒、游標(biāo)卡尺等。

1.1.5 試驗(yàn)儀器設(shè)備

光學(xué)顯微鏡（上海彼愛(ài)姆光學(xué)儀器制造有限公司）、高速離心機(jī)（湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司）、冰箱（奧克斯集團(tuán)有限公司）、氣浴恒溫振蕩器（常州澳華儀器有限公司）、生化培養(yǎng)箱（北京永光明醫(yī)療儀器有限公司）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮儀器有限公司）、干燥箱（北京永光明儀器有限公司）、分析天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］、高壓滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械有限公司）、超凈工作臺(tái)［林茂科技（北京）有限公司］。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)菌液制備

乳酸菌菌液制備：取乳酸菌菌粉0.1g接種至150mLMRS液體培養(yǎng)基中，在生化培養(yǎng)箱37℃靜置培養(yǎng)24h后將菌液離心，10000r/min離心10min，取上清液備用。芽孢桿菌菌液制備：取芽孢桿菌菌粉0.1g接種至150mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37℃、140r/min搖床培養(yǎng)24h后將菌液離心，10000r/min離心10min，取上清液備用。

1.2.2 指示菌菌懸液制備

將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌分別接種至LB液體培養(yǎng)基中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)12~15h，顯微鏡下觀察活菌生長(zhǎng)情況，將其稀釋至5×107CFU/mL菌懸液低溫備用。

1.2.3 指示菌平板的制備

涂布平板法：向已滅菌的培養(yǎng)皿中傾注20~25mL的LB固體培養(yǎng)基，水平靜置凝固，分別接種100μL金黃色葡萄球菌與大腸桿菌菌懸液，用棉棒涂布均勻后晾干低溫放置備用。

1.2.4 發(fā)酵菌種抑菌性能篩選

采用瓊脂擴(kuò)散牛津杯法測(cè)定發(fā)酵菌種抑菌活性。將牛津杯垂直放于已制備好的兩種指示菌平板上，用鑷子輕壓使其與培養(yǎng)基表面緊密接觸，分別向牛津杯中加入200μL試驗(yàn)菌種上清液，先室溫靜置1h后放于37℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)12~18h，觀察并用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑大小。每組測(cè)定兩個(gè)平行，最后結(jié)果取平均值。抑菌圈直徑越大，表明該菌種抑菌性能越強(qiáng)。

1.2.5 發(fā)酵飼料樣品的制備

將篩選出的抑菌性能較強(qiáng)的乳酸菌和芽孢桿菌按一定量混合成復(fù)合菌粉添加到飼料中，將復(fù)合菌粉與飼料原料混合，加入溫水制成水分為40%的樣品，40℃發(fā)酵4d，即為試驗(yàn)發(fā)酵樣品。

1.2.6 發(fā)酵樣品抑菌性能評(píng)估方法

1.2.6.1發(fā)酵樣品浸提液的制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取發(fā)酵樣品和飼料原料各100g，按照1:3體積比分別加入蒸餾水、80%無(wú)水乙醇、pH值7.5的緩沖溶液，在42℃，120r/min的條件下震蕩浸提3h，3 000r/min離心10min，收集上清液備用。

1.2.6.2發(fā)酵樣品浸提液的濃縮

取試驗(yàn)組與對(duì)照組的上清液樣品各100mL，分別旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后定容至50 mL，濃縮液收集備用。

1.2.6.3發(fā)酵樣品抑菌性能評(píng)估

將用不同溶劑浸提的試驗(yàn)組與對(duì)照組的浸提液與濃縮液用瓊脂擴(kuò)散牛津杯法評(píng)估抑菌性能，方法同文章1.2.4。

2.結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵菌種抑菌性能篩選

2.1.1 乳酸菌抑菌性能評(píng)估（見(jiàn)圖1、表1）

由圖1、表1可知，3株乳酸菌對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有抑制作用，與楊柳等的研究結(jié)果相符。其中L3乳酸菌的抑菌效果最為明顯，產(chǎn)生的抑菌圈直徑最大，對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑達(dá)1.96cm，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為1.98 cm。因此，后期選擇L3乳酸菌作為制備抑菌發(fā)酵飼料的乳酸菌菌種。