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鉻是人體必需的微量營養元素之一， 是人體內葡萄糖耐量因子（glucose tolerance factor，GTF）的有效活性成分。有機鉻是一類生物效價高的鉻源， 可以更顯著地促進動物生長，改善胴體品質和繁殖性能等。鉻進入動物機體后經腸道吸收，在血液里與運送鐵的球蛋白結合，而后被運至肝臟及全身。由于不同形式的鉻在組織中的結合程度不同，導致吸收率不同，因此鉻的吸收與化學結合形式有很大關系，無機鉻不但毒性大，且以極低水平吸收，吸收率約為0.4％~3.0％；有機鉻較無機鉻易被吸收，吸收率為10％~25％，其有效性約為無機鉻的10 倍以上。所以有機鉻是一種較有應用前景的鉻補充物。

在有機鉻制劑中， 高鉻酵母是通過微生物發酵方法制備的，具有生物活性高、毒性小、生產成本低等特點，并且還能同時補充一定量的氨基酸， 可以認為是一種具有較好應用前景的有機鉻補充物，用于防治疾病和作為飼料添加劑有著廣闊的應用前景。該試驗研究了1株產朊假絲酵母對無機鉻的富集及其影響因素，并對其發酵條件進行了優化，旨在為鉻酵母的工業化生產提供基礎依據。

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種

高生物量菌株產朊假絲酵母Candida utilisA7， 由山東寶來利來生物工程股份有限公司菌種保藏中心保存。

1.1.2 試劑

重鉻酸鉀（分析純）、二苯氨基脲、三氯化鉻（分析純）、乙醇、高錳酸鉀、硫酸、高氯酸、鹽酸。

1.1.3 試驗設備

水浴鍋、高壓滅菌鍋、超凈工作臺、恒溫搖床、高速離心機、電熱板、UV2000 紫外分光光度計。

1.1.4 培養基配方

斜面培養基配方為酵母膏5 g、蛋白胨10 g、葡萄糖20 g、KH₂PO₄ 2 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 000 mL。液體種子培養基：酵母膏5 g、蛋白胨10 g、葡萄糖20 g、KH₂PO₄ 2 g、蒸餾水1 000 mL。

發酵培養基：同液體種子培養基。

1.2 試驗方法

比較不同鉻添加量、接種量、培養溫度、裝液量、發酵初始pH 值、培養時間對富鉻酵母生物量及鉻含量的影響， 確定試驗用酵母菌株富集無機鉻的最佳發酵條件。

1.2.1 培養基中鉻離子濃度的確定

在液體發酵培養基中添加不同濃度的三氯化鉻，使Cr³⁺濃度分別為0、40、60、80、100、120、150 μg/mL（m/V），培養基初始pH 值5.0，121 ℃滅菌30 min，當溫度降至30 ℃時接種，接種量為4％（V/V），每500 mL 三角瓶裝液量為50 mL，于30 ℃，200 r/min 搖床培養20 h 結束，測定酵母的生物量和酵母細胞中有機鉻的含量，考察培養基中鉻離子濃度對酵母富集鉻的影響。

1.2.2 接種量的確定

選取溫度30 ℃，培養基中添加三氯化鉻至Cr³⁺濃度100 μg/mL （m/V）， 分別按2%、4%、6%、8%、10%（V/V）接種量接種，搖床轉速200 r/min，培養時間20 h，做不同接種量的單因素試驗，測定生物量及有機鉻的含量，考察接種量對酵母富集鉻的影響。

1.2.3 最適培養溫度的確定

培養基中添加三氯化鉻至Cr³⁺濃度100 μg/mL（m/V），在其他培養條件相同的情況下，分別在26、28、30、32 ℃下培養該酵母菌20 h， 測定生物量及酵母細胞中有機鉻的含量， 考察不同培養溫度對酵母富集鉻的影響。

1.2.4 裝液量（通氣量）對酵母富集鉻的影響試驗

每500 mL三角瓶裝液量分別為25、50、75、100、125 mL，培養基中添加三氯化鉻至Cr³⁺濃度20 μg/mL（m/V），初始pH 值為5.0，接種量4％（V/V），培養20 h，測定生物量及酵母細胞中有機鉻的含量，考察不同裝液量對酵母富集鉻的影響。

1.2.5 發酵培養基初始pH 值的確定

采用液體發酵培養基，培養基中添加三氯化鉻至Cr³⁺濃度100 μg/mL（m/V），初始pH 值分別調為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5， 每500mL 三角瓶裝液量在50 mL，接種量4％（V/V），培養20 h，測定其生物量和酵母細胞內有機鉻的含量， 考察發酵培養基不同初始pH 值對酵母富集鉻的影響。

1.2.6 發酵時間的確定

為確定不同培養時間對酵母生物量及鉻含量的影響，采用產朊假絲酵母菌株、實驗室7 L 機械攪拌發酵罐進行。發酵罐裝量為5 L，采用上述發酵培養基，發酵溫度30 ℃，4％（V/V）接種量，發酵培養基初始pH值為5.0，培養基中加入Cr³⁺濃度100 μg/mL（m/V）的三氯化鉻。試驗中每4 h 取樣1 次，測定生物量和酵母中有機鉻的含量，繪制富鉻酵母生長曲線及鉻富集曲線，以確定適宜的發酵時間。

1.2.7 發酵工藝穩定性研究

為了驗證上述試驗得出的最佳發酵工藝的穩定性（試驗結果的重現性），分別采用上述試驗所得最佳發酵工藝進行了5 個批次的發酵試驗， 測定生物量和酵母中有機鉻的含量， 計算變異系數以驗證發酵工藝的穩定性。

1.3 分析檢測

1.3.1 生物量的測定

將發酵液3 500 g 離心10 min，收集酵母菌體，蒸餾水洗滌3 次，除去培養基中無機鉻及其他成分，收集菌體，冷凍干燥后稱重即得（g/100 mL，m/V）。

1.3.2 富鉻酵母中有機鉻的測定

二苯氨基脲法。

1.3.2.1 原理

在酸性條件下， 樣品中全部鉻離子氧化成Cr⁶⁺，而在微酸性條件下，Cr⁶⁺可與二苯氨基脲（DPC）結合生成一種紫紅色絡合物，其最大吸收波長為540 nm，溶液顏色的深淺與生成物濃度成正比，即與Cr⁶⁺濃度成正比，鉻量在0~25 μg/mL 范圍內符合比耳定律。

1.3.2.2 有機鉻含量的測定

采用透析處理法使鉻酵母中的無機鉻和有機鉻得以分離，并對透析內液進行消化測定，便可測得鉻酵母中有機鉻的含量。

透析： 將新鮮的富鉻酵母置于pH 值8.6 的Tris-HCl-甘油緩沖液中，加入二氧化硅進行研磨。在電子顯微鏡下觀察，待酵母細胞完全破碎后，裝入事先處理好的透析袋內，扎緊上端，于蒸餾水中透析，期間不斷換水，并檢測透析外液中的鉻含量，直到透析外液中檢測不出鉻時停止透析。

消化： 取上述透析袋內液適量于100 mL 三角瓶中，加10 mL 硝酸，三角瓶頂部放小漏斗，在電熱板上微火加熱至發煙，稍冷卻后，加入3 mL 高氯酸繼續加熱，當溶液變為清亮無色并冒濃白煙時停止加熱，冷卻后，加入5 mL 6 mol/L濃鹽酸，繼續消化至冒白煙時（剩余體積2 mL 左右，切不可蒸干）結束，消化后有機鉻可被完全氧化成Cr⁶⁺。

標準曲線的繪制：取15 mL 具塞刻度試管6 支，分別加入鉻標準工作液（ 鉻濃度1.0 μg/mL，m/V）0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別加入1∶9 H₂SO₄ 5 mL，加入蒸餾水15 mL，加0.1 g/L 過硫酸銨溶液2 mL，加1 mg/mL 的硝酸銀溶液3 滴，混勻后，放入60 ℃水中，加熱至沸，保持25 min。冷卻后，加入5 mL 3 mol/L 氫氧化鈉溶液（pH 值1.5~2.0），搖勻，定容至25 mL，冷卻后，加入二苯氨基脲1.5 mL，搖勻，15 min 后測A540，繪制標準曲線。

測定方法：取消化處理后的樣品液適量，按標準曲線方法測定，并計算樣品中鉻的含量。

2.1 培養基中鉻離子濃度對酵母富集鉻的影響在4%接種量時，隨著培養基中Cr³⁺濃度的提高，富鉻酵母中有機鉻含量也會進一步提高，當達到100.0 μg/mL 時，出現了一個高峰值（見圖1）。但當培養基中Cr³⁺的濃度過高時，由于鉻元素的毒性作用，明顯抑制了酵母的生長和代謝，同化鉻到菌體內的代謝作用也受到了抑制。當發酵液中Cr³⁺的濃度超過100.0 μg/mL 時，酵母細胞的生長受到明顯抑制，表現為細胞體積變小，細胞分裂遲緩，生物量下降。該試驗結果表明，當培養基中加入Cr³⁺濃度在100.0 μg/mL 時為好。

2.2 接種量對酵母富集鉻的影響試驗從圖2 可以看出，隨著接種量的增加， 富鉻酵母的生物量及有機鉻的含量先增加后下降，生物量以接種量4%最高，而酵母細胞內鉻含量以接種量6%最高，經比較總富鉻效果后確定其最適接種量為4%~6%。

2.3 不同培養溫度試驗由圖3 可以看出， 在26~32 ℃范圍內， 發酵溫度對富鉻酵母的生物量以及酵母細胞內有機鉻的含量均有一定影響。富鉻酵母在30 ℃發酵時，酵母生

物量最大，細胞內有機鉻含量也最高，說明30 ℃最有利于產朊假絲酵母A7 對Cr³⁺的富集。

2.4 裝液量（通氣量）試驗由圖4 可以看出，裝液量對富鉻酵母的生長和富鉻能力有一定影響，試驗中500 mL 三角瓶裝液量50~75 mL 范圍內酵母細胞生物量和富鉻量均較高，隨著裝液量的增加，生物量和鉻含量都明顯下降?？梢娺m當減少裝液量以增加通氣量并能提高富鉻酵母的生物量和富鉻量，據此推斷，在發酵罐生產中可以適當加大通氣量以促進富鉻酵母生長和對鉻的吸收。

2.5 發酵培養基初始pH 值對生物量和酵母細胞內鉻含量的影響由圖5 可以看出， 初始pH 值對富鉻酵母的生長和富鉻能力有較大影響。當初始pH 值為5.0 時生物量及細胞內有機鉻的含量均達到最高。因此，初始pH 值應控制在5.0 為宜。

2.6 培養時間的確定由圖6 可以看出， 發酵罐生產富鉻酵母， 酵母細胞中有機鉻的含量在發酵初期生物量很低的情況下就達到較高的水平， 說明酵母對鉻的富集是隨著酵母的生長而同步進行的，有機鉻的含量在發酵16 h 達到最高，為2 210 μg/g，而其生物量在20 h 達到最大。綜合來看，在20 h 鉻的富集量達到最大，故發酵時間以20 h 為宜。

2.7 最優方案下制備的酵母測試結果最優工藝下制備的酵母生物量和有機鉻含量試驗結果見表1。

通過以上試驗得出富鉻酵母的最適發酵條件： 每500 mL

搖瓶裝量50 mL，溫度30 ℃，接種量4%~6％，發酵培養基最適初始Cr³⁺濃度為100 μg/mL，初始pH 值為5.0，發酵時間為20 h。對最優工藝條件下制備的富鉻酵母5 個批次的生物量、有機鉻含量及其變異系數來看，培養過程波動不大，基本穩定，說明該工藝切實可行。

①產朊假絲酵母（Candida utilis）是衛生部規定可用于保健食品的2 種酵母類菌種之一，在酵母類真菌中較之啤酒酵母在生物量方面具有明顯優勢， 故選擇產朊假絲酵母作為試驗用菌株。

②該試驗結果證實，產朊假絲酵母A7 菌株對鉻有相當的生物轉化能力， 但其對鉻的富集能力并不隨培養基中Cr³⁺濃度的升高而一直升高， 而是有一個最佳濃度。在100μg/mL 時，富集效果最好。低于100 μg/mL 時，隨著Cr³⁺濃度的增加，產朊假絲酵母A7 對鉻的富集量也逐漸提高，但當Cr³⁺濃度超過100 μg/mL 時， 則鉻的富集效果增加不明顯，且酵母的正常生長受到抑制作用。因而在工業化生產富鉻酵母時建議選擇在培養基中添加100 μg/mL Cr³⁺，發酵培養20 h 為宜。

據劉靜等研究推測， 鉻的富集可能與細胞膜表面的特殊蛋白載體有關，在低鉻濃度時，載體的運載能力大于細胞所能接觸到的鉻， 這時提高培養基中的鉻濃度可以提高富集效果；而當鉻濃度較高時，鉻離子相對過剩，鉻離子之間與載體競爭性結合而產生抑制， 反而使蛋白載體對鉻的運載能力下降。因此，富鉻酵母培養中鉻的添加量至關重要。這與該試驗結果基本一致。

③通過對產朊假絲酵母培養條件的研究發現，培養基中Cr³⁺添加濃度、接種量、發酵液的初始pH 值、溫度、轉速、時間都對富鉻酵母的生物量和富鉻能力有很大影響。

該試驗制備富鉻酵母的最佳工藝條件為培養溫度30 ℃、培養基鉻添加量100 μg/mL（m/V）、接種量體積分數為4%~6%（V/V）、培養起始pH 值為5.0、培養時間20 h。在該優化條件下獲得的富鉻酵母生物量可達到1.83g/100 mL， 有機鉻含量可達2210 μg/g。利用產朊假絲酵母制備富鉻酵母工藝條件的初步優化結果為發酵罐放大生產奠定了基礎。