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   飼用抗生素在促進(jìn)畜禽生長、提高飼料轉(zhuǎn)化效率、減少糧食損耗、提高動(dòng)物產(chǎn)品產(chǎn)量等方面具有顯著的效果。隨著抗生素在飼料中的長期廣泛使用，它的弊端正日益凸現(xiàn)，如導(dǎo)致動(dòng)物胃腸道菌群失調(diào)，產(chǎn)生細(xì)菌耐藥性和動(dòng)物產(chǎn)品藥物殘留等。

微生態(tài)制劑被認(rèn)為是抗生素的潛在替代物之一，已被廣泛關(guān)注。丁酸梭菌是從健康人和動(dòng)物腸道分離出來的一種嚴(yán)格厭氧的革蘭氏陽性芽孢桿菌，具有產(chǎn)丁酸、產(chǎn)酶、葉酸等益生物質(zhì)等特性。近年來，對(duì)丁酸梭菌的研究主要集中在生物醫(yī)學(xué)和生物化工方面，在飼料工業(yè)上研究相對(duì)較少。相比于非芽孢桿菌，丁酸梭菌具有較強(qiáng)的抗逆性，并能促進(jìn)動(dòng)物生長、調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道微生態(tài)平衡、提高機(jī)體免疫力，在畜牧生產(chǎn)中具有廣闊的應(yīng)用前景。

本研究旨在篩選出對(duì)動(dòng)物常見致病菌具有廣譜抑菌活性的產(chǎn)抑菌蛋白的丁酸梭菌菌株，對(duì)其進(jìn)行鑒定，并在體外研究其抗逆性和益生特性，為其在動(dòng)物生產(chǎn)應(yīng)用提供理論支撐。

1材料與設(shè)備

1.1材料與試劑

仔豬盲腸內(nèi)容物10份，取自3個(gè)豬場；大腸桿菌K88(E.coli K88)、金黃色葡萄球菌ATCC25923(S.aureus ATCC25923)；梭菌增值培養(yǎng)基(RCM培養(yǎng)基)、梭菌選擇性培養(yǎng)基(TSN培養(yǎng)基)、LB培養(yǎng)基，國產(chǎn)分析純；細(xì)菌生化微量反應(yīng)管、藥敏紙片；細(xì)菌DNA提取試劑盒；豬膽鹽，胰蛋白酶、蛋白酶K、過氧化氫酶，人工胃液、人工腸液根據(jù)中國藥典進(jìn)行配制；蛋白酶測定試劑盒、淀粉酶測定試劑盒、脂肪酶測定試劑盒。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分離培養(yǎng)方法

采用厭氧培養(yǎng)箱來進(jìn)行厭氧菌的液體培養(yǎng)、分離和稀釋平板計(jì)數(shù)。取盲腸內(nèi)容物10g加到90 mL PBS中，放人80℃水浴10 min以殺死非芽孢菌，放入RCM培養(yǎng)基，于37℃厭氧培養(yǎng)36 h；將樣品分別稀釋到10-3、10-5、10-7，涂布于TSN培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)48 h；采用影印平板法分離菌種，選取嚴(yán)格厭氧生長的菌株，進(jìn)行鏡檢；根據(jù)丁酸梭菌的培養(yǎng)特性、菌落形態(tài)和顯微形態(tài)等特征，挑選符合特性的菌株進(jìn)行生理生化鑒定和16S rDNA序列分析。

1.2.2產(chǎn)抑菌蛋白的丁酸梭菌篩選

發(fā)酵上清菌液：分離的菌株在RCM液體培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)24 h作為種子液；種子液按1％接種于新的RCM液體培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)24 h作為發(fā)酵液。以8000 r/min，4℃離心10 min，取上清液備用。

指示菌的制備：LB培養(yǎng)基培養(yǎng)。種子液按1％接種于LB液體培養(yǎng)基中37℃，200 r/min搖床過夜，稀釋到107CFU/mL備用。

抑菌試驗(yàn)初篩：采用孔穴瓊脂擴(kuò)散法。接種E.coliK88和S.aureus ATCC25923至LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜后轉(zhuǎn)接1％至5 mL體積LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)(200 r/min，37℃至OD600=0.6左右；滅菌后的250 mL LB固體培養(yǎng)基冷卻至45～50℃時(shí)加入1‰的上述菌液，混勻后倒板；凝固后，用打孔器(孔徑5 mm)在平板上打孔，分別加入50μL發(fā)酵上清菌液，陰性對(duì)照加入等體積的RCM培養(yǎng)基，3個(gè)重復(fù)/樣，置于37℃培養(yǎng)24 h，測定抑菌圈直徑。

抑菌試驗(yàn)復(fù)篩：發(fā)酵液和指示菌液體制備同上。檢測各發(fā)酵液的pH值，對(duì)上清液進(jìn)行排酸、過氧化氫酶和蛋白酶處理，孔穴瓊脂擴(kuò)散法測定其抑菌活性。

1.2.3丁酸梭菌的鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：將目標(biāo)菌株涂板于RCM培養(yǎng)基平板，37℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)，挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。

生理生化鑒定：運(yùn)用細(xì)菌微量生化反應(yīng)管對(duì)菌株進(jìn)行生理生化特征分析。

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16SrDNA基因序列分析鑒定：細(xì)菌總DNA提取采用細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取。PcR引物序列：7F:5'-CAGAGTITGATCCTGGCT-3’、1540R:5'  AG-GAGGTGATCcAGcCGCA-3';反應(yīng)體系(25μL):5xBuffer(with Mg2+)2.5μL;dNTP(各2.5mmol/L)1μL；7F(10 μmol/L)0.5μL；1540R(10μmol/L)0.5μL；基因組DNA(50 ng/μL)0.5 μL；TaKaRaExTaq酶(5U/μL)0.3μL；加雙蒸水至25μL。PCR擴(kuò)增程序：98℃預(yù)變性3 min，98℃變性25 s，55％退火25 s，72℃延伸1min，進(jìn)行30循環(huán)，最后72℃延伸4 min。PCR產(chǎn)物利用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，片段為1500 bp左右的陽性產(chǎn)物經(jīng)純化后送上海生工序列測定。運(yùn)用NCBI上的BLAST將測得的基因序列和GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比較；利用mega6.0構(gòu)建丁酸梭菌系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4丁酸梭菌的體外益生功能研究

1.2.4.1耐人工胃液和人工腸液研究

耐人工胃液能力研究取生長末期培養(yǎng)物離心(3000r/min，10 min)，PBS洗滌2次后重懸，以107/mL接種于人工胃液中，震蕩混勻，37℃水浴孵育，每隔0.5 h取樣進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，3個(gè)重復(fù)/樣；耐人工腸液能力研究將經(jīng)過人工胃液處理后的菌體離心(3000 r/min，10 min)，PBS洗滌2次后重懸，以107/mL接種于人工腸液中，實(shí)驗(yàn)步驟同上。

1.2.4.2耐膽鹽研究

耐膽鹽能力研究在RCM液體培養(yǎng)基加入使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別0.15％、0.20％、0.25％、0.30％、0.35％、0.40％的豬膽鹽，121℃、15 min滅菌。菌種按1％接種，37℃靜置培養(yǎng)，觀察菌體生長變化。

1.2.4.3抗生素敏感性研究

抗生素敏感性用無菌玻棒將菌液(108/mL)均勻涂布在RCM平板上，攝取各種藥敏紙片，分別緊貼于培養(yǎng)基表面，37℃厭氧培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈的直徑，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定，3個(gè)重復(fù)/樣。

1.2.4.4產(chǎn)酶活性研究

蛋白酶活力測定采用福林酚法進(jìn)行測定，采用蛋白酶測定試劑盒進(jìn)行測定。淀粉酶活力測定：采用碘一淀粉比色法，采用淀粉酶測定試劑盒進(jìn)行測定。脂肪酶活力測定：采用比濁法測定，采用脂肪酶測定試劑盒進(jìn)行測定。

1.2.4.5產(chǎn)酸特性研究

揮發(fā)性脂肪酸測定采用頂空一氣相色譜儀(Agilent6890)測定。菌液上清液用6％H3PO3，溶液按1：2(m/V)混懸后密封于頂空進(jìn)樣瓶中，直接進(jìn)行HS-GC檢測。頂空震蕩室加熱溫度80℃、震蕩加熱時(shí)間28 min，進(jìn)樣針溫度為100℃，分流進(jìn)樣，分流比3：1；采用DB-FFAP毛細(xì)管柱(30 mx0.25min x0.25μm)，進(jìn)樣口溫度220℃，升溫程序?yàn)槌跏紲囟?/span>80℃，以10℃/min升至230℃，保持2 min。恒流模式，載氣流速為1.4 mL/min，FID檢測器，檢測器溫度250℃。

1.3統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS Statistics18.0軟件中的One-Way ANOVA進(jìn)行方差分析，采用Duncan's法進(jìn)行多種比較，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2結(jié)果

2.1丁酸梭菌分離與篩選

2.1.1丁酸梭菌的分離

從樣品中分離出21株嚴(yán)格厭氧的革蘭氏陽性細(xì)菌。根據(jù)細(xì)菌的菌落形態(tài)、細(xì)菌形態(tài)及嚴(yán)格厭氧特性能鑒定到屬，經(jīng)鑒定，12株菌株符合梭菌屬細(xì)菌特性。根據(jù)梭菌屬內(nèi)的菌株進(jìn)行芽孢位置染色實(shí)驗(yàn)和明膠液化實(shí)驗(yàn)可以鑒定到群，在群內(nèi)只需進(jìn)行蜜二糖、松三糖和淀粉利用實(shí)驗(yàn)，即可鑒定到種。分離到的12株梭菌進(jìn)行芽孢染色實(shí)驗(yàn)、明膠液化實(shí)驗(yàn)和糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如表1所示，根據(jù)結(jié)果判定菌株ZJU-F1、ZJU-F2、ZJU-K3、ZJU-Y2、ZJU-Y3、ZJU-Z2為丁酸梭菌。

2.1.2產(chǎn)抑菌蛋白的丁酸梭菌篩選

對(duì)篩選到的6株丁酸梭菌，使用孔穴瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行發(fā)酵上清液的抑菌活性實(shí)驗(yàn)。發(fā)酵上清液經(jīng)過酸排、H2O2酶、和蛋白酶(胰蛋白酶、蛋白酶K)處理后與上清液原液相比，抑菌活性結(jié)果如圖1、表2、表3所示。各菌株發(fā)酵液pH較低，酸排除處理后，ZJU-Y2、ZJU-Y3、ZJU-Z2菌株的發(fā)酵上清液抑菌活性消失，但pH4.5的乙酸、丁酸溶液對(duì)照并無抑菌活性。H2O2酶處理后抑菌活性并無顯著差異，胰蛋白酶、蛋白酶K處理后抑菌活性則消失，說明起抑菌作用的物質(zhì)是蛋白質(zhì)。菌株ZJU-F1、ZJU-F2、ZJU-K3的發(fā)酵上清液對(duì)E.coliK88和S.aureus ATCC25923均具有抑菌活性。選擇菌液抑菌活性最強(qiáng)的ZJU-F1菌株作為目標(biāo)菌株進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.2丁酸梭菌ZJU—F1的鑒定

2.2.1形態(tài)學(xué)鑒定

丁酸梭菌ZJU-F1菌株在RCM固體平板培養(yǎng)12 h后，形態(tài)如圖2-A所示，菌落呈奶油色圓形菌落，邊緣整齊、不十分規(guī)則、稍突、表面濕潤光滑，不透明，有酸臭味。挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，如圖2-B所示，細(xì)菌直徑為(0.6～1.2)x(3.0～7.0)μm，端圓，中間部分輕度膨脹，單個(gè)或成對(duì)，短鏈，偶見有絲狀菌體，孢子卵圓、次端生，紅色箭頭為芽孢。

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2.2.2生理生化鑒定

丁酸梭菌ZJU-F1的生理生化試驗(yàn)和對(duì)不同碳源發(fā)酵利用情況試驗(yàn)結(jié)果如表4所示對(duì)照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》檢索，初步鑒定結(jié)果為丁酸梭菌。

2.2.316S rDNA序列同源性分析

以菌株丁酸梭菌ZJU-F1的DNA為模板，16S rDNA通用引物進(jìn)行擴(kuò)增后得到約1500 bp的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。經(jīng)同源性比對(duì)，菌株與C.butyricum的同源性達(dá)100％，屬于梭菌屬群1丁酸梭菌種，系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。

2.3體外益生功能研究

2.3.1耐人工胃液和人工腸液研究

丁酸梭菌ZJU-F1的人工胃液和人工腸液耐受結(jié)果如表5所示，pH=2的人工胃液對(duì)丁酸梭菌ZJU-F1的存活幾乎沒有影響。經(jīng)人工胃液消化后，丁酸梭菌對(duì)人工腸液仍具有良好的耐受性，作用2.5 h后，細(xì)菌數(shù)目仍然沒有顯著變化。

2.3.2膽汁耐受性研究

不同消化道部位膽鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)不同，豬小腸中膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.03％~0.3％波動(dòng)。由表6可以看出，ZJU-F1耐膽鹽能力較強(qiáng)，在0.35％的膽鹽培養(yǎng)能中仍能生長。

2.3.3抗生素敏感性研究

丁酸梭菌ZJU-F1對(duì)抗生素的敏感性和相容性如表7所示，青霉素類、頭孢類和四環(huán)素類抗生素對(duì)丁酸梭菌ZJU-F1的抑菌作用較強(qiáng)，在飼料生產(chǎn)中不宜配伍；丁酸梭菌ZJU-F1對(duì)多肽類、氨基糖苷類和喹諾酮類抗生素耐受性較強(qiáng)，在動(dòng)物生產(chǎn)中可以配伍。

2.3.4丁酸梭菌分泌消化酶活性實(shí)驗(yàn)

如表8所示，丁酸梭菌ZJU-F1能分泌淀粉酶和蛋白酶，不產(chǎn)生脂肪酶。當(dāng)該菌株在動(dòng)物腸道存活繁殖時(shí)，就可能分泌淀粉酶和蛋白酶來輔助消化，提高飼料的消化率和動(dòng)物生長性能。

2.3.5丁酸梭菌分泌有機(jī)酸實(shí)驗(yàn)

丁酸梭菌ZJU-F1分泌的有機(jī)酸結(jié)果如表9所示，當(dāng)丁酸梭菌在動(dòng)物腸道存活繁殖時(shí)，丁酸梭菌能分泌丁酸、乙酸等有機(jī)酸到周圍環(huán)境中，降低動(dòng)物腸道pH值，同時(shí)丁酸是動(dòng)物腸道上皮細(xì)胞的能量物質(zhì)，能增強(qiáng)動(dòng)物腸道屏障功能。

3討論

3.1產(chǎn)抑菌蛋白的丁酸梭菌分離、篩選和鑒定

丁酸梭菌，根據(jù)其產(chǎn)芽孢的特性，對(duì)樣品進(jìn)行熱處理以殺死非芽孢菌，涂布TSN培養(yǎng)基平板后初步得到純菌株，再通過影印厭氧和好氧培養(yǎng)，得到嚴(yán)格厭氧菌。接著對(duì)所得到的菌株進(jìn)行明膠液化實(shí)驗(yàn)、芽孢位置染色實(shí)驗(yàn)和糖醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)鑒定到丁酸梭菌種。

抑菌試驗(yàn)常用方法包括孔穴瓊脂擴(kuò)散法、牛津杯法、濾紙片法和濁度法等，瓊脂擴(kuò)散法具有操作便捷結(jié)果驗(yàn)證有效且更加直觀等優(yōu)點(diǎn)被廣泛使用。菌液的抑菌活性則是通過其發(fā)酵過程中產(chǎn)生各種代謝產(chǎn)物包括酸性物質(zhì)(有機(jī)酸)、過氧化氫酶和抑菌蛋白等來實(shí)現(xiàn)的。本試驗(yàn)采用孔穴瓊脂擴(kuò)散法對(duì)E.coli K88和S.aureus ATCC25923的抑菌效果表明，抑菌圈直徑小于6 mm時(shí)抑菌活性較低，且發(fā)酵上清液對(duì)不同指示菌的抑菌效果并不相同。

為了得到產(chǎn)抑菌蛋白的丁酸梭菌，排除丁酸梭菌在發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)物對(duì)結(jié)果的影響，本試驗(yàn)采用酸排除、H2O2排除等消除干擾因素。利用H2O2酶處理發(fā)酵上清后發(fā)現(xiàn)抑菌活性無明顯影響，而調(diào)整pH至5.5后抑菌活性有所減弱，說明pH對(duì)抑菌活性有影響，而pH=4.5的乙酸、丁酸的培養(yǎng)基對(duì)照并無抑菌活性，說明抑菌活性并非由于酸性物質(zhì)所致，但低pH環(huán)境可以增強(qiáng)其他抑菌物質(zhì)的抑菌活性。發(fā)酵上清經(jīng)胰蛋白酶、蛋白酶K處理后抑菌活性消失；說明發(fā)酵液中抑菌活性為蛋白質(zhì)，可以初步確定其為細(xì)菌素，且該細(xì)菌素可被蛋白酶降解而不在體內(nèi)殘留，具有較高的安全性。

傳統(tǒng)的菌落和細(xì)菌形態(tài)學(xué)、生理生化鑒定分析方法不能準(zhǔn)確的鑒定出細(xì)菌的種屬。16S rDNA序列是編碼核糖體RNA小亞基16S rRNA的基因，具有高度保守的特性。16S rDNA技術(shù)則是通過對(duì)遺傳特征的保守性序列分析，能夠判斷出細(xì)菌間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，從而準(zhǔn)確的鑒定細(xì)菌的種屬，該方法因其準(zhǔn)確、快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)已成為細(xì)菌鑒定有力手段之一。

本研究通過嚴(yán)格厭氧條件下產(chǎn)芽孢確定其為梭菌屬細(xì)菌，并通過芽孢位置實(shí)驗(yàn)、明膠液化、糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)鑒定到種，最后通過16S rDNA序列分析技術(shù)鑒定。

3.2丁酸梭菌的體外益生功能研究益生菌制劑

作為飼料添加劑，需經(jīng)過口腔、胃后進(jìn)入腸道發(fā)揮益生功能，這就要求益生菌制劑能夠耐受動(dòng)物機(jī)體的防御機(jī)制。丁酸梭菌因具有產(chǎn)芽孢的特性，能夠耐受各種消化酶、胃酸和膽汁的影響，具有較強(qiáng)的抗逆性，本試驗(yàn)篩選的丁酸梭菌ZJU-F1對(duì)人工胃液、人工腸液和膽汁具有較高耐受能力。

益生菌制劑的菌種選育標(biāo)準(zhǔn)要求篩選的菌株對(duì)常用抗生素具有較高敏感性，以證明菌株本身不含有耐藥性質(zhì)粒。而在實(shí)際動(dòng)物生產(chǎn)中，飼料特別是幼齡飼料往往添加一定量的抗生素以防病和促生長，從而影響了益生菌的使用效果。因此，研究益生菌對(duì)各種藥物的敏感性及配伍禁忌及其重要。本研究表明，丁酸梭菌ZJU-F1可和多肽類氨基酸苷類、喹喏酮類抗生素聯(lián)合使用。

丁酸梭菌在動(dòng)物腸道內(nèi)產(chǎn)生對(duì)宿主的健康具有重要的生理意義的多種代謝產(chǎn)物，包括蛋白酶、淀粉酶、乙酸、丁酸等益生物質(zhì)等。幼齡動(dòng)物因其消化功能發(fā)育不全、消化酶分泌不足，導(dǎo)致生長性能受阻。丁酸梭菌能產(chǎn)蛋白酶和淀粉酶，在動(dòng)物生產(chǎn)中應(yīng)用可以提高動(dòng)物的消化性能，從而提高飼料利用率。

揮發(fā)性脂肪酸(如甲酸、乙酸、丙酸、丁酸)，對(duì)動(dòng)物腸道健康起到重要作用。丁酸是動(dòng)物腸道上皮細(xì)胞首選能源底物，具有促進(jìn)動(dòng)物生長、改善小腸形態(tài)、促進(jìn)小腸消化吸收并增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體免疫等功能。丁酸梭菌ZJU-F1在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)生長繁殖可分泌大量的消化酶、乙酸、丁酸，在提高動(dòng)物消化功能的同時(shí)具有降低腸道pH，并發(fā)揮抑菌效應(yīng)，增強(qiáng)動(dòng)物免疫功能的效果。

4結(jié)論

本研究仔豬盲腸內(nèi)容物中分離到6株丁酸梭菌，通過多重抑菌實(shí)驗(yàn)對(duì)菌株進(jìn)行初篩和復(fù)篩，得到產(chǎn)高活性抑菌蛋白的丁酸梭菌ZJU-F1。對(duì)目標(biāo)菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化和16S rDNA基因序列同源性分析，鑒定結(jié)果為丁酸梭菌。丁酸梭菌ZJU-F1具較強(qiáng)的抗逆性和益生功能，作為飼料益生菌制劑具有很大的應(yīng)用潛力。