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中國是農(nóng)業(yè)大國，玉米作為主要種植的農(nóng)作物，其副產(chǎn)物玉米秸稈資源更為豐富，年產(chǎn)量約2億t。玉米秸稈是有著巨大潛力而尚未被充分開發(fā)利用的飼料資源，玉米秸稈中含有豐富的營養(yǎng)成分，是反芻動(dòng)物粗飼料的主要原料之一。但是，就我國目前的情況來說，被用作飼料的玉米秸稈卻很少。這主要是因?yàn)橛衩捉斩捴写值鞍?CP)含量較低，中性洗滌纖維(NDF)含量較高，而使其適口性較差。正常情況下，一般要求反芻動(dòng)物飼料CP含量不低于8％，而玉米秸稈中CP含量低于8％，且消化率低，導(dǎo)致瘤胃內(nèi)沒有足夠的氮源，最終影響到瘤胃微生物的增殖和發(fā)酵翻。因此，為了克服這些限制玉米秸稈作為飼料利用的因素，提高其利用價(jià)值，我們需要對(duì)玉米秸稈進(jìn)行物理、化學(xué)和生物學(xué)處理，以改善玉米秸稈品質(zhì)，解決其存在的消化能低、適口性差以及粗蛋白含量低的問題，從而研發(fā)出適合我國反芻動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)使用的優(yōu)質(zhì)粗飼料。同時(shí)也能更好的利用這個(gè)豐富而廉價(jià)的資源，解決我國反芻動(dòng)物粗飼料利用率低的難題。

然而，當(dāng)飼料進(jìn)入瘤胃后，瘤胃中微生物發(fā)酵飼料中非纖維性碳水化合物和植物纖維，產(chǎn)生可吸收利用的揮發(fā)性脂肪酸(VFA)的同時(shí)，瘤胃內(nèi)產(chǎn)甲烷菌生成大量的甲烷。瘤胃內(nèi)飼料總能量的12％左右以甲烷的形式損失掉的同時(shí)，甲烷作為溫室氣體也極大地加劇全球變暖。全球每年甲烷的排放量約為525Tg，其中反芻動(dòng)物甲烷的排放量約為85Tg。大量的反芻動(dòng)物不僅需要提供龐大數(shù)量的飼料，而且排放甲烷量也急劇上升。因此，利用秸稈調(diào)制發(fā)酵生物飼料，在擴(kuò)大飼料來源，節(jié)約飼料成本，減少資源的浪費(fèi)，降低空氣污染，同時(shí)也能減少瘤胃甲烷的排放，對(duì)減緩地球變暖具有重要意義。

研究通過添加糖蜜和乳酸菌，對(duì)風(fēng)干玉米秸稈進(jìn)行小規(guī)模發(fā)酵處理，常溫貯存30d后開封，感官評(píng)定發(fā)酵玉米秸稈的物理性狀，分析水分，pH以及微生物組成及數(shù)量，探討玉米秸稈發(fā)酵飼料調(diào)制的可行性技術(shù)，提高豐富而廉價(jià)的玉米秸稈資源的利用率。

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用風(fēng)干玉米秸稈來源于黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)田；糖蜜采購自濟(jì)南市歷城區(qū)圣茂化工有限公司；乳酸菌制劑(LAB，Lactobacillus plantarum，購自日本雪印公司)。

1.2 玉米秸稈的發(fā)酵及處理

采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)處理包括無添加組、乳酸菌(LAB)、糖蜜(Molasses)以及乳酸菌和糖蜜共同(LAB+M)添加組。將收獲籽粒后的風(fēng)干玉米秸稈粉碎至1-2cm，菌液按照每公斤飼料1mL添加，糖蜜的添加量為4％。添加蒸餾水調(diào)整水分為60％并混合均勻。發(fā)酵用塑料袋尺寸為16x25cm，每個(gè)處理3袋，每袋200g，使用真空密封機(jī)(AT-620，北京吉奧德，北京)，真空密封包裝室溫貯存30d后開封，測定各項(xiàng)指標(biāo)。

1.3 菌種準(zhǔn)備

將乳酸菌制劑用滅菌水溶解，每毫升菌液中含活乳酸菌數(shù)不少于1.0x105 cfu(Colony-Forming Units)，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/span>

1.4 培養(yǎng)基

預(yù)先配制足夠的固體培養(yǎng)基，包括培養(yǎng)乳酸菌(MRS，de man，rogosa，sharpe agar)、大腸桿菌(BLU，blue light broth agar)、酵母菌和霉菌(PDA，potatodexuose agar)、好氧菌和奶熱菌(NA，nutrient agar)、酪酸菌(CLO，clostridial agar)的培養(yǎng)基，以上培養(yǎng)基均購自青島海博生物有限公司。

1.5 pH測定方法

開封后，立即從4種發(fā)酵玉米秸稈樣品中分別取20g，放入聚乙烯袋內(nèi)，再加入180mL蒸餾水，隨后，用均質(zhì)器拍打90s，再用定性濾紙進(jìn)行過濾，收集濾液，同時(shí)測定濾液的pH。

1.6 發(fā)酵玉米秸稈物理性狀的感官評(píng)定

根據(jù)青貯質(zhì)量評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)的說明，主要從質(zhì)地、氣味、色澤和有無霉變這4個(gè)方面進(jìn)行感官評(píng)定。

1.7 微生物培養(yǎng)與細(xì)菌形態(tài)及計(jì)數(shù)

試驗(yàn)分別對(duì)4種處理的發(fā)酵玉米秸稈樣品中所含有的乳酸菌、大腸桿菌、酵母菌、霉菌、好氧菌、耐熱細(xì)菌和酪酸菌進(jìn)行培養(yǎng)與計(jì)數(shù)。首先，制作足夠數(shù)量的MRS、BLU、NA、DRCA、PDA(需加入20％酒石酸)的固體培養(yǎng)基備用。按照Cao等所述的方法，將4種處理的發(fā)酵玉米秸稈樣品待測菌液的原菌液依次進(jìn)行梯度稀釋，分別稀釋為10倍液、30倍液及50倍液，大腸桿菌、好氧菌和耐熱細(xì)菌、酵母菌和霉菌分別在BLU、NA、PDA培養(yǎng)基上30℃恒溫培養(yǎng)48 h；乳酸菌、酪酸菌分別在MRS、CLO培養(yǎng)基上30℃恒溫厭氧培養(yǎng)48 h。最后，觀察平板上長出的菌落，依依進(jìn)行區(qū)分并計(jì)數(shù)(單位質(zhì)量新鮮樣品中微生物數(shù)量cfu·g-1)。

1.8  In Vitro體外培養(yǎng)

1.8.1 人工唾液

采用McDougll's緩沖液的配制方法進(jìn)行配制，1 L人工唾液的組成分別為NaHCO3(9.8g)，KCl(0.57g)，CaCl2(0.04g)，NaH2PO4 12H2O(9.3g)，NaCl(0.47g)，MgSO4 ·7H2O(0.12g)，Cysteine hydrochloride(0.25g)，Resazurin(0.001g)。

1.8.2 瘤胃液的收集

3頭安裝永久性瘤胃瘺管的綿羊提供瘤胃液。上午采食2 h后，通過3頭綿羊的瘤胃瘺管進(jìn)行采集瘤胃液，采集的瘤胃液用4層紗布過濾后，等體積混合，并通入CO2保持厭氧環(huán)境。

1.8.3 培養(yǎng)液的制備

人工唾液和瘤胃液以體積比4：1的比例混合后，通人CO2，并置于39℃水浴鍋中備用。

1.8.4 生物飼料培養(yǎng)

稱取粉碎(2mm)的風(fēng)干樣品1g，分別置于體積為128mL的培養(yǎng)瓶中，稱取50mL的培養(yǎng)液注入培養(yǎng)瓶內(nèi)，通入氮?dú)獗３謪捬醐h(huán)境，立即蓋上膠蓋，并用專用封口鉗子壓緊鋁蓋，將培養(yǎng)瓶置于恒溫震蕩水浴鍋內(nèi)，39℃震蕩培養(yǎng)48h。

1.8.5 干物質(zhì)消失率、pH及甲烷測定

根據(jù)Cao Y的方法，分別對(duì)培養(yǎng)后樣品的干物質(zhì)消失率、培養(yǎng)液的pH以及甲烷進(jìn)行了測定。

1.9 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)采用SAS9.0軟件對(duì)4組秸稈生物發(fā)酵飼料水分、pH、in vitro干物質(zhì)消失率和瘤胃甲烷生成量的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和多重比較。

2.1 感官評(píng)定

各組玉米秸稈經(jīng)30 d發(fā)酵處理，其中無添加處理的玉米秸稈顏色為褐黃色、松軟不粘手、有酒酸味，無發(fā)霉現(xiàn)象。經(jīng)其他3種處理的玉米秸稈質(zhì)地柔軟、疏松稍濕潤，松軟不粘手，無發(fā)霉現(xiàn)象，顏色為黃色，有淡酸味。結(jié)果見表1。根據(jù)玉米秸稈青貯感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，得出各處理的感官評(píng)分均在51分以上(總分100分)。屬于良好的黃貯玉米秸稈。

2.2 秸稈生物發(fā)酵的水分與pH

玉米秸稈經(jīng)過無添加、M、LAB、M+LAB 4種處理后的水分和pH見表2。4種處理水分含量關(guān)系為LAB>無添加>M>M+LAB，各處理間差異不顯著(P>0.05)。經(jīng)過LAB、M+LAB處理后的pH顯著(P<0.05)低于糖蜜處理組。

2.3 秸稈生物發(fā)酵飼料的微生物組成及數(shù)量

發(fā)酵玉米秸稈飼料中微生物組成及數(shù)量見表3。乳酸菌在4個(gè)處理組中的數(shù)量為106～107(cfu·g-1)；大腸桿菌僅在無添加組檢測出106(cfu·g-1)；好氧菌在4個(gè)試驗(yàn)處理組中的數(shù)量為106～107(cfu·g-1)；耐熱細(xì)菌在添加組和對(duì)照組中的數(shù)量分別為103和105(cfu·g-1)；酵母菌在和M添加組中的數(shù)量為106(cfu·g-1)，而在LAB和M+LAB添加組中為102(cfu·g-1)；在添加組和對(duì)照組均沒有發(fā)現(xiàn)酪酸菌和霉菌。

2.4 In Vitro干物質(zhì)消失率和瘤胃甲烷生成量

不同處理對(duì)秸稈飼料體外培養(yǎng)干物質(zhì)消失率和甲烷生成量的影響見表4。糖蜜、乳酸菌以及二者共同添加組的干物質(zhì)消失率顯著高于無添加組(P<0.05)，而乳酸菌添加組的甲烷生成量顯著低于無添加組和糖蜜添加組(P<0.05)。

試驗(yàn)從水分、pH、色澤、氣味、質(zhì)地等方面分別對(duì)無添加、M、LAB、M+LAB 4種處理的發(fā)酵玉米秸稈進(jìn)行感官評(píng)定。經(jīng)30 d發(fā)酵后，無添加處理的玉米秸稈顏色為褐黃色、質(zhì)地松軟不粘手、有淡酸味，無發(fā)霉現(xiàn)象；經(jīng)其他三種處理的玉米秸稈質(zhì)地疏松稍濕潤、不粘手，無發(fā)霉現(xiàn)象，顏色為黃色，有醇香味。各處理的感官評(píng)分均在51分以上，屬于良好的黃貯玉米秸稈。但是，試驗(yàn)為黃貯玉米秸稈，而感官評(píng)定中參考的是玉米秸稈青貯感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，所以水分含量比青貯玉米水分含量稍低。其中，LAB和M+LAB處理的玉米秸稈感官評(píng)分最高，而M的處理評(píng)分次之，這說明LAB處理對(duì)發(fā)酵玉米秸稈的發(fā)酵品質(zhì)有益。

青貯秸稈的發(fā)酵品質(zhì)主要由pH值和有機(jī)酸含量(乳酸、乙酸、丙酸、丁酸)等決定。pH是評(píng)價(jià)青貯飼料品質(zhì)最簡單且最直觀的指標(biāo)之一，pH越低，有機(jī)酸含量越高，青貯越容易保存。玉米秸稈發(fā)酵時(shí)，水分越高，發(fā)酵品質(zhì)越差，試驗(yàn)中各個(gè)處理的水分都在60％左右，故發(fā)酵效果較好。同時(shí)，pH的高低也是判斷風(fēng)干玉米秸稈青貯是否成功的重要指標(biāo)，當(dāng)青貯玉米秸稈的pH在4.0以下時(shí)，青貯質(zhì)量為優(yōu)等；當(dāng)pH在4.1～4-3時(shí)，青貯質(zhì)量較為良好；當(dāng)pH在4.4～5.0時(shí)，青貯質(zhì)量較為一般；而當(dāng)pH在5.0以上時(shí)，青貯質(zhì)量則為劣等。由此可見，試驗(yàn)中無添加組黃貯玉米秸稈質(zhì)量較為一般，LAB、M+LAB處理組的pH顯著下降，發(fā)酵質(zhì)量較好，發(fā)酵玉米秸稈青貯中的有害微生物處于被抑制狀態(tài)。

玉米秸稈黃貯中，乳酸菌是具有重要作用的益生菌，其種類和數(shù)量對(duì)發(fā)酵玉米秸稈品質(zhì)有很大影響；酵母菌能夠提高奶牛干物質(zhì)采食量，產(chǎn)奶量以及消化粗蛋白和酸性洗滌纖維的能力；而霉菌是飼料中的有害菌，不僅會(huì)造成飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的損失，還會(huì)危害家畜和人的健康。一般情況下，發(fā)酵品質(zhì)良好的飼料，由于pH較低，會(huì)抑制微生物包括乳酸菌的活性。

試驗(yàn)中，4種發(fā)酵飼料的乳酸菌均在106~107之間，說明試驗(yàn)所用的玉米秸稈附著一定數(shù)目的乳酸菌，并且由于乳酸菌的耐酸性較強(qiáng)，在密封發(fā)酵的過程中能夠進(jìn)行繁殖。添加高效產(chǎn)酸LAB后，發(fā)酵飼料中可溶性糖生成乳酸，降低pH，抑制了酵母菌活性，大腸桿菌和霉菌被完全抑制。所以，在LAB添加組中，乳酸菌有輕微的減少，而酵母菌明顯減少，這與以前對(duì)發(fā)酵稻草的研究結(jié)果相似。

飼料在發(fā)酵過程中，乳酸菌利用原料中的可溶性糖生成乳酸，降低pH，抑制有害微生物，減少養(yǎng)分損失。改變了碳水化合物的組成和降解特性，而碳水化合物的組成和降解特性在很大程度上決定了瘤胃內(nèi)甲烷的生成量。根據(jù)甲烷生成量的預(yù)測模型：甲烷生成量(g·d-1)=91+50x可消化纖維素(kg·d-1)+40x可消化半纖維素(ks·d-1)+24x可消化淀粉(kg·d-1)+67x可消化糖(kg·d-1)(R2=0.84)。通常發(fā)酵飼料中的乳酸菌和其他菌類很容易發(fā)酵分解糖分、淀粉及一部分纖維素，轉(zhuǎn)變?yōu)榫w蛋白等并生成有機(jī)酸，降低了飼料中一部分碳水化合物，即改變了碳水化合物組成，并且發(fā)酵生成的有機(jī)酸可以直接被瘤胃或微生物吸收利用，使他們不參與瘤胃內(nèi)發(fā)酵，可能導(dǎo)致甲烷生成量減少。

試驗(yàn)中，盡管糖蜜和乳酸菌共同添加可以促進(jìn)秸稈生物飼料乳酸發(fā)酵，降低pH，減少養(yǎng)分損失，進(jìn)而提高干物質(zhì)消失率。但由于添加糖蜜增加了飼料中的可消化糖分，便導(dǎo)致瘤胃甲烷生成量的增加。如上所述，乳酸菌添加后，可以分解秸稈中可溶性糖生成乳酸，減少了甲烷生成量等式中的可消化糖的含量，進(jìn)而降低瘤胃甲烷的生成。

添加乳酸菌以及LAB+M可以降低pH，抑制有害微生物的生長，減少飼料養(yǎng)分損失，促進(jìn)玉米秸稈生物飼料發(fā)酵。同時(shí)添加乳酸菌也可以提高體外培養(yǎng)干物質(zhì)消失率，減少瘤胃甲烷生成。