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乳酸菌（Lactobacillus）是發(fā)酵糖類且主要產(chǎn)物為乳酸的一類無芽孢、革蘭氏染色陽性細(xì)菌的總稱，乳酸菌廣泛存在于自然界和人畜的消化系統(tǒng)中，幾乎所有菌都對(duì)人和動(dòng)物無毒、無害，可以促進(jìn)人和動(dòng)物的健康，由于具備多種益生功能，使其在醫(yī)藥、生物技術(shù)、食品、飼料等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。截止2010 年， 我國乳酸菌產(chǎn)業(yè)規(guī)模已經(jīng)超過200 億元，產(chǎn)量突破160萬噸。在養(yǎng)殖業(yè)，由于抗生素的使用日漸威脅人類的健康和環(huán)境安全，世界各國已普遍禁用或限用飼用抗生素，與之相反，微生物飼料添加劑在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中已經(jīng)得到廣泛的認(rèn)可和使用，其中最受推崇的就是乳酸菌。乳酸菌在動(dòng)物體內(nèi)能發(fā)揮許多的生理功能，它們能促進(jìn)動(dòng)物生長，調(diào)節(jié)胃腸道正常菌群、維持微生態(tài)平衡，改善胃腸道功能；提高食物消化率和生物效價(jià)； 降低血清膽固醇，控制內(nèi)毒素；抑制腸道內(nèi)腐敗菌生長，提高機(jī)體免疫力，防治多種腸道疾病。2008 年12 月我國農(nóng)業(yè)部1126 號(hào)公告《飼料添加劑品種目錄（2008）》中規(guī)定的可以直接飼喂動(dòng)物的飼料級(jí)微生物添加劑菌種，共16 種：地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、兩歧雙歧桿菌（Bifidobacteriumbifidum）、糞腸球菌（Straptoccus faecium）、屎腸球菌（Enterococcus lactis）、乳酸腸球菌（Lactobacillus acidophilus）、嗜酸性乳桿菌（Lactobacillusacidophilus）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、乳酸乳桿菌（Lactobacillus lactis）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、乳酸片球菌（Pediococcusacidilacticii）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis）、釀酒酵母、（Saccharomycescerevisiae）、沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudomonaspalustris）、保加利亞乳桿菌（Lactobacillusbulgaricus），其中11 種為乳酸菌。

盡管乳酸菌在養(yǎng)殖業(yè)中的意義重大，但其生物飼料添加劑的規(guī)模還是比較小，目前市場(chǎng)份額大約為10 億元左右，這主要是因?yàn)槟壳叭樗峋难芯亢?/span>應(yīng)用更多地集中在發(fā)酵乳制品（益生菌酸奶、益生菌發(fā)酵乳飲料、益生菌奶酪）、發(fā)酵豆乳制品、功能性食品配料和食品添加劑（如在嬰兒配方乳粉、中老年乳粉、果汁等中的添加等）、膳食補(bǔ)充劑（片劑、膠囊等）等方面，研究的方向集中在發(fā)酵菌劑的研制和使用等方面，由此，也造成了乳酸菌飼料添加劑研發(fā)的滯后。要為消費(fèi)者提供更多健康的肉類食品，必須加快飼用乳酸菌工業(yè)化生產(chǎn)的研究。目前情況下，乳酸菌飼料添加劑的規(guī)模化生產(chǎn)需要解決如下三個(gè)問題：一是原料廉價(jià)易得，最好是廢棄的農(nóng)副產(chǎn)品；二是工藝要低碳環(huán)保，盡量減少能源消耗和二次污染；三是操作簡便，不需要添加外源物質(zhì)，就能生產(chǎn)出高密度的乳酸菌。為此，研究者們作出了不懈努力，如劉曉紅等以玉米粉、麥麩等為固態(tài)基質(zhì),對(duì)一株植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）進(jìn)行了固態(tài)混合發(fā)酵試驗(yàn)， 培養(yǎng)結(jié)束后乳桿菌活菌數(shù)可達(dá)100.5×108CFU/g（鮮基）；方芳等以玉米粉、豆粕、麥麩為基質(zhì)對(duì)保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌進(jìn)行固態(tài)混合發(fā)酵， 在40℃時(shí)得出最好發(fā)酵結(jié)果，各菌活菌數(shù)在109CFU/g 以上。許贛榮等則發(fā)明了一種利用糖渣培養(yǎng)乳酸菌及生產(chǎn)乳酸活菌飼料的方法，以玉米淀粉制糖工業(yè)副產(chǎn)物糖渣為主要原料，添加麩皮、蛋白胨等物質(zhì)，并采用固態(tài)分批、液態(tài)分批、或液態(tài)補(bǔ)料的方式， 液態(tài)培養(yǎng)活菌含量109CFU/mL以上， 固態(tài)培養(yǎng)活菌含量109CFU/g 以上的乳酸菌劑。但是，對(duì)照規(guī)模化生產(chǎn)需要解決的三個(gè)問題，上述研究離工業(yè)化生產(chǎn)的要求還有一定距離。在我國，每年都有數(shù)以萬噸計(jì)的菠蘿渣、羅漢果渣、燒仙草渣、馬蹄淀粉廢水、馬蹄渣等農(nóng)產(chǎn)品加工廢棄物，量大而且相對(duì)集中，對(duì)其進(jìn)行資源化利用，意義十分重大。本文研究了植物乳桿菌對(duì)上述農(nóng)副產(chǎn)品廢棄物的利用情況，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了一種利用馬蹄淀粉廢水、馬蹄渣生產(chǎn)乳酸菌飼料添加劑的方法。

1.1 材料

1.1.1 菌種

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），本實(shí)驗(yàn)室分離保存，標(biāo)記為LP199。菌劑為干粉，活菌含量400B/g。

1.1.2 各種農(nóng)副產(chǎn)品廢棄物

菠蘿渣：菠蘿經(jīng)壓榨機(jī)壓榨取汁后的果渣，取自合浦果園香公司；

羅漢果渣：鮮羅漢果經(jīng)浸提壓榨后的果渣，主要為羅漢果核，取自桂林某公司；

燒仙草渣：燒仙草干草經(jīng)浸提后的草渣，取自廣西宇峰公司；

馬蹄淀粉廢水：馬蹄經(jīng)勻漿、去渣和流槽沉淀后的廢水，取自廣西某公司；

馬蹄渣：馬蹄勻漿經(jīng)漿渣分離再作壓濾后之渣，取自廣西某公司。

1.2 方法

1.2.1 可資利用農(nóng)副產(chǎn)品廢棄物的快速篩選

取植物乳桿菌菌劑0.4g， 加入1000mL 滅菌生理鹽水中，混勻，制得1×108CFU/mL 的菌種液。將菌種液按1∶10 的比例分別接種到下列試驗(yàn)編號(hào)的樣品中：

1#：450g 菠蘿渣，加450mL 蒸餾水，置1000mL廣口瓶中；

2#：450g 羅漢果渣，加450mL 蒸餾水，均質(zhì)，置1000mL 廣口瓶中；

3#：450g 燒仙草渣，加450mL 蒸餾水，均質(zhì)，置1000mL 廣口瓶中；

4#：900mL 馬蹄淀粉廢水，置1000mL 廣口瓶中；

5#：450g 馬蹄渣，加450mL 蒸餾水，置1000mL廣口瓶中。

接種后，密封置30℃發(fā)酵，24h 后，做感官、菌相鏡檢及pH 值測(cè)定，其中pH 用檢定合格的pH 計(jì)測(cè)定。上述樣品同時(shí)另備一份，相應(yīng)編號(hào)為A、B、C、D、E，做發(fā)酵前的感官、菌相鏡檢及pH 值測(cè)定。選取發(fā)酵后色澤、氣味較好，革蘭氏陽性短桿菌較多且純，pH 值較低的樣品作為植物乳桿菌可資源化利用的基質(zhì)。

1.2.2 LP199 對(duì)選用基質(zhì)營養(yǎng)成分的利用實(shí)驗(yàn)

對(duì)篩選出的基質(zhì)，重復(fù)上述試驗(yàn)，同時(shí)檢測(cè)其發(fā)酵前后的總糖、蛋白質(zhì)、總酸（以乳酸計(jì)）、乳酸、脂肪、淀粉、粗纖維、膳食纖維等營養(yǎng)成分，分析其前后之變化。各成分的檢測(cè)分別按GB/T 5009.8-2008、GB 5009.5-2010、GB/T 12456-2008、SN/T 2007-2007、GB/T 5009.6-2003、GB/T 5009.9-2008、GB/T 5009.10-2003、GB/T 5009.88-2008 等方法進(jìn)行。

對(duì)固體廢渣再做氨基酸檢測(cè)， 分析其發(fā)酵前后之變化。氨基酸的檢測(cè)按GB/T 5009.124-2003方法進(jìn)行。

1.2.3 利用選擇基質(zhì)生產(chǎn)乳酸菌劑的試驗(yàn)

試驗(yàn)前，先在現(xiàn)場(chǎng)取樣，測(cè)可溶性固形物，測(cè)pH值，鏡檢，檢測(cè)菌落總數(shù)。可溶性固形物用手持式折光儀直接讀數(shù)，菌落總數(shù)按GB 4789.2-2010 檢測(cè)。試驗(yàn)時(shí)，先將植物乳桿菌菌種液按1∶10 的比例直接接入基質(zhì)中過夜進(jìn)行一級(jí)放大， 然后再按同樣的比例接種進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)酵24h 后，鏡檢，感官檢查，測(cè)pH 值，測(cè)乳桿菌數(shù)，同時(shí)作對(duì)照試驗(yàn)。

2.1 可資利用農(nóng)副產(chǎn)品廢棄物的快速篩選結(jié)果

用植物乳桿菌LP199 對(duì)菠蘿渣、羅漢果渣、燒仙草渣、馬蹄淀粉廢水、馬蹄渣等進(jìn)行了發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)果如表1 所示。

本試驗(yàn)所用的菌種LP199，為一種植物乳桿菌，系革蘭氏陽性桿菌， 分散排列， 菌體大小為0.8-1.0μm×1.0-2.0μm。從表1 中可以看出，植物乳桿菌在菠蘿渣中未能占據(jù)主導(dǎo)地位， 大量生長的是一種革蘭氏陽性鏈桿菌；羅漢果渣發(fā)酵后總體菌量較少，并且酵液發(fā)臭； 燒仙草接種培養(yǎng)后呈現(xiàn)混合菌相，pH 值未能顯著下降，并且出現(xiàn)產(chǎn)氣和腐爛味；因此上述三種廢渣均不適合作為生產(chǎn)乳酸菌劑的基質(zhì)。而馬蹄淀粉廢水和馬蹄渣發(fā)酵后，pH 值迅速下降，具有特殊發(fā)酵的酸香味，菌體主要為植物乳桿菌，所以本研究首先選取此兩種物質(zhì)作為培養(yǎng)植物乳桿菌的基質(zhì)。

2.2 LP199 對(duì)馬蹄淀粉廢水和馬蹄渣營養(yǎng)成分的利用結(jié)果

將LP199 接種于馬蹄淀粉廢水和馬蹄渣后，檢測(cè)其發(fā)酵前后之總糖、蛋白質(zhì)、總酸等營養(yǎng)成分，結(jié)果如表2 所示。

從表2 中可以看出，發(fā)酵后，總糖接近零值，而總酸大大增加。總酸成分主要為乳酸，如馬蹄淀粉廢水中乳酸/總酸比值為82%， 馬蹄渣中乳酸/總酸比值為98%，說明LP199 是行同型乳酸發(fā)酵，如此高濃度的乳酸足以將其它細(xì)菌抑制或殺滅， 這為其免于對(duì)基質(zhì)的熱處理從而實(shí)現(xiàn)低碳發(fā)酵奠定了基礎(chǔ)。發(fā)酵前后，蛋白質(zhì)、脂肪、淀粉的含量沒有明顯變化，提示LP115 和其它大多數(shù)乳酸菌一樣，缺乏這些物質(zhì)的分解酶系， 其生長所需因子主要來源于馬蹄淀粉廢水和馬蹄渣中已有的營養(yǎng)物質(zhì)， 同時(shí)也說明此廢水和廢渣利用前景廣闊。

本實(shí)驗(yàn)同時(shí)檢測(cè)的還有馬蹄渣發(fā)酵前后氨基酸含量，結(jié)果如表3 所示。

從表3 中可以看出，經(jīng)LP199 發(fā)酵后，馬蹄渣中的氨基酸由4.400g/100g 增加到了5.743g/100g，總量增加了30.5%。個(gè)例氨基酸中， 只有胱氨酸減少，其余全部增加，增加50%以上的有谷氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸和精氨酸，其中后5 種氨基酸為畜禽必需氨基酸。氨基酸的變化反映出植物乳桿菌LP199 復(fù)雜的生理代謝作用，由于氨基酸本身就是乳酸菌的良好底物， 所以發(fā)酵后氨基酸的增加可能來源于菌體的增加， 提示LP199菌體是一種優(yōu)良的單細(xì)胞蛋白。

2.3 馬蹄淀粉廢水、馬蹄渣生產(chǎn)乳酸菌劑的試驗(yàn)結(jié)果

將菌種放大一級(jí)后再分別接種于馬蹄淀粉廢水和馬蹄渣，自然環(huán)境條件下密封放置，試驗(yàn)結(jié)果如表4 所示。本試驗(yàn)于2012 年12 月23 日和2013 年2月1 日在生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行了兩次， 日平均氣溫20-15℃，結(jié)果為兩次試驗(yàn)的平均數(shù)。

從表4 中可以看出， 馬蹄淀粉廢水和馬蹄渣基質(zhì)中，含有一定的雜菌，數(shù)量在106CFU/mL（g）以上，主要是一些革蘭氏陽性小球菌， 如果不接種LP199，24h后， 該菌就會(huì)大量繁殖， 菌體密度達(dá)到109CFU/mL（g）以上。而接入10%的LP199 一級(jí)放大菌液后，LP199 的生長居于主導(dǎo)地位，培養(yǎng)液中幾乎全為植物乳桿菌，由于沒有其它外源菌，表中乳桿菌的量就是LP199 的量，它在馬蹄淀粉廢水中的純度是91.7%，在馬蹄渣中的純度則幾乎是100%，而且密度較高，活菌數(shù)在109CFU/mL（g）以上。

由于目前我國還沒有乳酸菌菌劑的國家或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，如果以農(nóng)業(yè)部光合細(xì)菌菌劑的標(biāo)準(zhǔn)作為生物菌劑的判定依據(jù)， 則可發(fā)現(xiàn)本試驗(yàn)得到的乳酸菌菌劑數(shù)量的雜菌率均滿足其要求， 是一種優(yōu)良的生物飼料添加劑， 特別是馬蹄渣中還含有大量的膳食纖維（見表2），更顯其作為飼料添加劑的優(yōu)越性。

本文研究發(fā)現(xiàn)了一種利用馬蹄淀粉廢水、馬蹄渣生產(chǎn)植物乳桿菌飼料添加劑的新方法， 該方法具有原料廉價(jià)易得、工藝低碳環(huán)保、操作簡便可行的特點(diǎn)，由此生產(chǎn)的生物飼料添加劑可廣泛應(yīng)用于畜禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖。

植物乳桿菌屬于乳桿菌屬（Lactobacillus），其營養(yǎng)要求比較復(fù)雜，需要氨基酸、核酸衍生物、維生素和可發(fā)酵的糖等，因此，并不是所有的農(nóng)副產(chǎn)品廢棄物都可被其利用，如菠蘿渣、羅漢果渣、燒仙草渣就不適用，實(shí)際上，還曾做過廢棄柑橘和廢棄柿子的研究，二者更難被利用；研究發(fā)現(xiàn)，馬蹄淀粉加工的廢棄物是培養(yǎng)植物乳桿菌LP199 的優(yōu)良基質(zhì)。馬蹄淀粉加工過程中產(chǎn)生的廢水、廢渣， 可溶性固形物達(dá)1.5-2.0%，實(shí)際上可看作是馬蹄勻漿的上清液（因廢渣含水量也達(dá)到79.6%），其中蘊(yùn)含著豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，非常適合植物乳桿菌的生長，植物乳桿菌接種到馬蹄淀粉的廢水廢渣后，能迅速增殖，產(chǎn)生大量的乳酸，使pH 值降低到4.0 以下，抑制和殺滅其它微生物，使雜菌率控制在10%以內(nèi)，這一培養(yǎng)特性正可以用于生物飼料添加劑的工業(yè)化生產(chǎn)， 因其不需要添加任何外源物質(zhì)，不需要任何熱處理措施，甚至可以做到零排放。

馬蹄渣更有利于植物乳桿菌LP199 的增殖，與馬蹄淀粉廢水相比，不僅活菌含量更高，而且菌物更純，純度幾乎是100%。有趣的是，馬蹄渣接種植物乳桿菌LP199 培養(yǎng)后，其氨基酸含量增加了30.5%，這可能歸結(jié)于菌體蛋白的增加， 提示菌體本身可作為高質(zhì)量的單細(xì)胞蛋白，不過，由于氨基酸的總含量不高， 所以其意義更多地在于植物乳桿菌的大量增殖可使之足以達(dá)到發(fā)揮對(duì)動(dòng)物的益生作用， 同時(shí)通過改善馬蹄渣的營養(yǎng)成分，增加其適口性，從而增加其作為生物飼料添加劑的性價(jià)比。

采用一級(jí)放大，二級(jí)10%的接種量，自然環(huán)境條件下直接培養(yǎng)，無需任何特殊的工藝，即可將馬蹄淀粉廢水和馬蹄渣變?yōu)榛罹?09CFU/mL（g 鮮重）以上的乳酸菌飼料添加劑。由于乳酸菌對(duì)環(huán)境敏感，不易保存，因此，還需對(duì)其活性保存條件作進(jìn)一步研究。

以年產(chǎn)2.0×106kg 馬蹄淀粉來計(jì)，馬蹄淀粉廢水、馬蹄渣量將分別達(dá)到1.2×107kg 和4.5×106kg 左右，其量大，而且相對(duì)集中，因此對(duì)其進(jìn)行資源化利用生產(chǎn)乳酸菌飼料添加劑，前景廣闊，同時(shí)馬蹄濕渣中還含有13.5g/100g 的膳食纖維， 折合干基含量為67.6g/100g，這將大大增加其作為生物飼料添加劑的潛在價(jià)值。