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微生態制劑對圍產期牦牛瘤胃微生物及發酵功能的影響

2020-06-15 09:26:10      點擊:

摘 要:試驗旨在研究微生態制劑對圍產期牦牛血液生化、瘤胃微生物區系和瘤胃發酵功能的影響。將20頭牦牛,按照年齡、體重、胎次及生理狀態相近的配對原則,分為對照組和處理組(微生態制劑),飼喂期42d,在不同日齡收集血清和瘤胃液。結果表明,與對照組相比,微生態制劑可以降低血液中β-羥丁酸(BHBA)濃度和瘤胃液中乳酸濃度,增加瘤胃液中丙酸濃度;顯著增加瘤胃液中反芻月形單胞菌和棲瘤胃普雷沃氏菌數量,降低黃色瘤胃球菌數量。研究表明,微生態制劑通過影響圍產期牦牛瘤胃微生物,可以改善牦牛瘤胃發酵功能和產后代謝紊亂。

瘤胃是一個復雜的生態系統,反芻動物采食的營養物質通過發酵過程被消化,發酵過程由各種微生物如細菌、原生動物和真菌執行。為了提高反芻動物生產效率,微生態制劑等飼料添加劑常用來改善反芻動物的發酵功能。此外,微生態制作為飼料添加劑在動物飼喂中主要作用是改善動物生產性能,并在單胃動物和水生動物中取得了良好的效果。微生態制劑可調節瘤胃微生態環境,促進幼齡反芻動物瘤胃功能的完善,提高瘤胃pH值和揮發性脂肪酸濃度,但在反芻動物中研究相對較少,特別是牦牛。因此,本試驗通過在日糧中添加微生態制劑,研究微生態制劑對圍產期牦牛血清生化、瘤胃發酵功能、瘤胃微生物區系的影響,為微生態制劑在牦牛生產中的應用提供參考依據。

1材料與方法

1.1 試驗材料

微生態制劑由本實驗室前期制備,制備方法為真空干燥法,主要成分為釀酒酵母、產朊假絲酵母、伯頓畢赤酵母、反芻月形單胞菌和埃氏巨型球菌,含活菌總數大于2×109CFU/g。

1.2 試驗動物及日糧

在拉薩市林周縣選擇體重、體況相似、健康、處于妊娠中期的牦牛20頭,按照年齡、體重、胎次及生理狀態相近的配對原則將其分為對照組與復合微生態制劑飼喂組(以下簡稱飼喂組),每組10頭,基礎口糧相同,對照組不飼喂,飼喂組牦牛每頭每天飼喂5g復合微生態制劑,飼喂期42d。微生態制劑飼喂方式為精飼料中混合飼喂。試驗日糧包括精料和粗料,單頭飼喂,每日2次,自由飲水。精料成分根據NRC(2000)肉牛營養需要和中國肉牛飼養標準(2013)設計,補充精料組成及營養水平見表1。

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1.3 瘤胃液和血液的采集與處理

圍產期牦牛分別在分娩-21、-14、-7、1、7、14和21d,于晨飼后4和8h從牛瘤胃腹囊下部抽取瘤胃液,每次采集約50mL,將所采集的瘤胃液混合。采集的瘤胃液用四層紗布過濾,取30mL濾液于液氮中凍存,用于檢測細菌數量及種類。剩余的濾液經3500r/min離心10min,取上清液于-20℃凍存,用于檢測pH值、氨態氮、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸。從牦牛靜脈采集5mL血液于肝素鈉管中,3500r/min離心5min,取血清,放置于-80℃凍存,用于檢測各種生化指標。

1.4 血清生化指標的測定

測定的血清生化指標包括:血清總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、葡萄糖(GLU)、堿性磷酸酶(ALP)、尿素氮(BUN)、甘油三脂(TG)、總膽固醇(CHO)、尿素氮(BUN)、肌酐酸(CRE)、谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶采用全自動生化分析儀(日立7170s全自動生化分析儀)進行測定。球蛋白(GLO)測定采用試劑盒(南京建成生物有限公司)利用免疫比濁法進行測定,β-羥丁酸測定采用試劑盒(南京建成生物有限公司)利用免疫比濁法進行測定。

1.5 瘤胃液指標的測定

瘤胃液pH值采用pH計測定,瘤胃液中氨態氮采用比色法測定,乙酸、丙酸、丁酸、乳酸根據標準法使用water-baseline 810液相色譜儀進行測定。

1.6 瘤胃微生物水平的測定

細菌總DNA的提取采用天根生化科技(北京)有限公司細菌DNA提取試劑盒,操作方法按照說明書進行,采用NanoDrop one(Thermo Fisher Scientific)測定DNA濃度。以細菌總DNA為模板,采用熒光定量PCR檢測瘤胃乳酸桿菌、牛鏈球菌、反芻月形單胞菌、埃氏巨型球菌、產琥珀酸絲狀桿菌、白色瘤胃球菌、黃色瘤胃球菌、嗜淀粉瘤胃細菌、溶纖維丁酸弧菌、布氏普雷沃氏菌、普雷沃氏短桿菌、棲瘤胃普雷沃氏菌、厭氧弧桿菌的水平。引物序列參考NCBI中各菌種序列設計,引物序列如表2所示,細菌數量的相對表達水平以真細菌校正后進行分析,分析方法參考Berglund等的方法。

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1.7 數據統計與分析

數據采用EXCEL 2016初步統計后,使用SPSS 19.0進行顯著性檢測分析,結果以“平均值±標準誤”表示,P<0.05表示差異顯著。

2結果與分析

2.1 微生態制劑對牦牛血液生化指標的影響(見表3~表5)

由表3可知,在圍產期不同時點,總蛋白和球蛋白水平在產后顯著增加(P<0.05),但是微生態制劑飼喂沒有影響,兩者無交互作用。在對照組和微生態制劑組中,與圍產期-21d相比,不同時間點白蛋白、堿性磷酸酶、尿素氮、肌酐酸、谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶濃度差異不顯著(P>0.05)。

由表4、表5可知,對照組和微生態制劑組中血清中葡萄糖在圍產前期增加,產后下降至正常水平,甘油三酯濃度在圍產期下降,膽固醇濃度則先下降后增加至正常水平。然而在微生態組中β-羥丁酸濃度則下降,且差異顯著(P=0.039)。

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2.2 微生態制劑對瘤胃發酵功能的影響(見表6、表7)

由表6、表7可知,對照組和微生態制劑組pH值和氨態氮水平均無顯著差異(P>0.05);對照組和微生態制劑組乙酸水平均無顯著差異(P>0.05),但微生態制劑可增加產后乙酸濃度(P=0.083);圍產期內丙酸濃度無顯著差異,但微生態制劑可以顯著增加產后丙酸的濃度(P=0.034);圍產期內丁酸濃度無顯著變化,同時微生態制劑對丁酸濃度也無影響;在產后,瘤胃內乳酸濃度在對照組和微生態制劑組顯著增加(P=0.013,P=0.048),與對照組相比,微生態制劑降低瘤胃液中乳酸濃度(50%)。

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2.3 微生態制劑對瘤胃微生物的影響(見表8)

由表8可知,對照組中,乳酸桿菌數量在產后1d最高,隨后下降,但差異不顯著(P>0.05),微生態制劑組沒有變化。對照組中,韋榮球菌科的反芻月形單胞菌和埃氏巨型球菌數量沒有顯著變化,但微生態制劑組的反芻月形單胞菌顯著增加(P<0.05)。纖維桿菌門中,琥珀酸絲狀桿菌的數量在對照組在產后1d最高,隨后下降,但差異不顯著,微生態制劑組中則在產后保持相同水平。瘤胃球菌科中,對照組白色瘤胃球菌數量呈先下降后增加,而微生態制劑組則在圍產期內保持增加但差異不顯著;對照組黃色瘤胃球菌數量無顯著變化,微生態制劑組顯著下降。圍產期內對照組和微生態制劑組的嗜淀粉瘤胃菌數量顯著增加,但微生態制劑沒有影響。對照組的溶纖維丁酸弧菌數量呈先增加后下降,而在微生態制劑組則無變化。普雷沃氏菌科中,布氏普雷沃氏菌數量在對照組和微生態制劑組均下降,但差異不顯著;普雷沃氏短桿菌數量在對照組中增加,但微生態制劑組呈先增加后下降。棲瘤胃普雷沃氏菌數量在對照組呈先增加后下降,而微生態制劑組則顯著增加。厭氧弧桿菌數量在對照組和微生態制劑組顯著增加,但兩組間差異不顯著。

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3討 論

血液中GLU濃度是動物機體能量代謝水平的重要體現,而GLU來源主要包括揮發性脂肪酸為前體物的合成和瘤胃內淀粉的分解吸收,在圍產期前后GLU水平的變化體現了動物對GLU合成與利用能力的變化,本研究中微生態制劑對GLU濃度沒有影響,與Hassan等的結果不相同,但與Norton的研究結果類似,可能由于添加劑與物種之間的差異。TP包括GLO和ALB,在圍產期內呈現規律性變化,表明在產后由于泌乳的蛋白需要,體內蛋白合成代謝受到影響,而微生態制劑對圍產期牦牛的蛋白代謝無影響,這與楊朋飛的結果不同,但與Stella等的研究結論一致。在泌乳過程中由乳腺合成乳脂肪是前體物之一是β-羥丁酸,而高濃度的β-羥丁酸會抑制乳腺細胞中脂肪的合成。本試驗中,微生態制劑顯著降低產后血液中β-羥丁酸的濃度,表明可能對糖脂代謝有一定的影響。而在圍產期內TG和TC的水平同樣呈規律性的變化,但微生態制劑并無顯著影響,表明微生態制劑可能通過糖異生途徑影響脂肪代謝過程。微生態制劑對血液中肌酐酸、谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶濃度無顯著影響,表明飼喂微生態制劑對圍產期牦牛機體健康未產生不良影響。

瘤胃內環境發酵機能是反映牛消化代謝狀況的重要指標,由于在圍產期內飼糧組分的變化,瘤胃內微生物種類和數量產生快速變化,同時在產后為了維持乳液的分泌,牛體內能量動員易引起圍產期代謝紊亂。發酵產生的揮發性脂肪酸吸收后通過糖異生或直接氧化供能方式參與動物機體的供能,丙酸則是主要的生糖前質。瘤胃液中pH值會影響瘤胃內微生物菌群組成,保持穩定的瘤胃液pH值對瘤胃發酵功能至關重要,而pH值主要受飼糧結構引起的發酵模式的影響。本研究中,圍產期內pH值、氨態氮、乙酸、丙酸、丁酸水平沒有變化,但乳酸水平顯著增加,這與奶牛中的變化相同。微生態制劑飼喂增加瘤胃液中乙酸和丙酸的水平,并降低乳酸水平,對pH值、氨態氮和丁酸濃度無影響,結果與酮病奶牛和亞急性、急性瘤胃酸中毒的奶牛添加微生態制劑結果相同。泌乳奶牛飼喂釀灑酵母也可以增加瘤胃液中丁酸的濃度。瘤胃液中乳酸濃度過高是由于相應產乳酸產生菌過量增殖產生的,而過多乳酸會引起瘤胃酸中毒導致機體代謝紊亂。圍產期內牦牛瘤胃液中乳酸水平增加,微生態制劑可以顯著減少乳酸水平并增加乙酸和丙酸的水平,說明微生態制劑可能通過增加乳酸的利用,增加丙酸等生糖前體的供給,改善圍產期的代謝紊亂。

瘤胃發酵產物的質量和數量取決于瘤胃微生物的種類和活性,瘤胃微生物生態系統非常多樣化。反芻月形單胞菌和埃氏巨型球菌是瘤胃中主要的丙酸生成菌,也是發酵乳酸生成揮發性脂肪的優勢菌,其中反芻月形單胞菌占瘤胃總細菌數量的51%。本研究中,微生態制劑可以顯著增加反芻月形單胞菌數量,但對埃氏巨型球菌數量沒有影響。Nisbet等研究表明,日糧中添加啤酒酵母可以增加瘤胃中反芻月形單胞菌數量,進而增加瘤胃中揮發性脂肪酸的濃度,尤其是丙酸的濃度。瘤胃中70%的乳酸是由埃氏巨型球菌發酵分解,并以丙酸為最終產物。產后奶牛灌服埃氏巨型球菌可以改變發酵方式,顯著增加瘤胃中揮發性脂肪酸的濃度,尤其是丙酸的濃度,改善機體的代謝。但本研究中,微生態制劑對圍產期瘤胃中埃氏巨型球菌沒有影響。在體外試驗中,白色瘤胃球菌生長過程中會分泌出一些抑制因子,對黃色瘤胃球菌的增殖起到排斥作用,但當環境內反芻月形單胞菌占優勢時,黃色瘤胃球菌即會表現出更明顯的生長優勢。而本研究中黃色瘤胃球水平降低,可能是白色瘤胃球菌和反芻月形單胞菌共同作用的結果。棲瘤胃普雷沃氏菌是瘤胃中的優勢菌群,它在瘤胃中是數量最多的蛋白質降解菌,表明微生態制劑可能對瘤胃內蛋白質的消化代謝產生影響。

4結論

圍產期牦牛飼喂微生態制劑可以降低血液中β-羥丁酸濃度;降低瘤胃液中乳酸濃度,增加丙酸濃度;顯著增加芻月形單胞菌種棲瘤胃普雷沃氏菌數量,降低黃色瘤胃球菌數量。

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