添加菌酶復(fù)合制劑發(fā)酵玉米秸稈的試驗(yàn)

2020-06-17 09:21:02 點(diǎn)擊：

摘要：本試驗(yàn)旨在探究菌酶復(fù)合制劑發(fā)酵玉米秸稈的最佳發(fā)酵條件及發(fā)酵效果。運(yùn)用均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)，以中性洗滌纖維降解率、酸性洗滌纖維降解率為目的指標(biāo)，對(duì)黃孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)接種量、纖維素酶和木聚糖酶添加量及發(fā)酵天數(shù)4個(gè)因素進(jìn)行篩選，并對(duì)發(fā)酵效果進(jìn)行評(píng)價(jià)和比較分析。結(jié)果表明:菌酶復(fù)合制劑發(fā)酵玉米秸稈的干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)含量顯著高于未發(fā)酵秸稈(P＜0.05)，酸性洗滌木質(zhì)素、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維含量顯著低于未發(fā)酵秸稈(P＜0.05)。本研究所獲得的最佳發(fā)酵條件為:纖維素酶添加量0.2g/kg，木聚糖酶添加量0.1g/kg，黃孢原毛平革菌接種量20%，發(fā)酵天數(shù)19d;在此條件下，玉米秸稈的中性洗滌纖維降解率和酸性洗滌纖維降解率分別達(dá)到了23.47%和20.13%。

近年來(lái)，隨著我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)技術(shù)水平的不斷提高，糧食產(chǎn)量逐年攀升，導(dǎo)致農(nóng)作物秸稈的數(shù)量也在不斷增加。有效利用農(nóng)作物秸稈作為飼料資源不僅可緩解人畜爭(zhēng)糧這一矛盾，還可以降低秸稈處理的成本并減少焚燒處理帶來(lái)的環(huán)境污染。然而秸稈細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)復(fù)雜，難以被動(dòng)物消化吸收，從而造成秸稈的堆積浪費(fèi)。玉米秸稈由細(xì)胞壁中的木質(zhì)素和半纖維素相互交聯(lián)并將纖維素鑲嵌于內(nèi)，以牢固的醚鍵或酯鍵連接;同時(shí)，木質(zhì)素又包圍著纖維素形成一種外圍基質(zhì)，致使微生物和酶對(duì)半纖維素、纖維素的降解受到限制，而且動(dòng)物體內(nèi)又缺乏降解木質(zhì)素的酶，導(dǎo)致家畜對(duì)玉米秸稈的利用率較低。通過(guò)黃貯，既可降低秸稈的纖維組分含量，又可改善發(fā)酵品質(zhì)，還有利于長(zhǎng)期保存。馮沖凌在堆肥中接入黃孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)，其木質(zhì)素降解率較對(duì)照組提高了10.9%;Zhi等通過(guò)試驗(yàn)對(duì)小麥秸稈在30℃條件下固態(tài)發(fā)酵12d，其木質(zhì)素降解率達(dá)到(28.5±1.3)%，使木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)明顯破壞;Chen等在玉米秸稈和低芥酸菜籽殘?jiān)薪臃N黃孢原毛平革菌，結(jié)果表明，其纖維素和木質(zhì)素含量分別降低了40.0%和64.3%。國(guó)內(nèi)外有關(guān)秸稈黃貯的研究多集中在乳酸菌及產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌等方面，但如果不解決木質(zhì)素的問(wèn)題，其纖維素酶的降解作用也會(huì)受到影響。黃孢原毛平革菌是白腐真菌的一種，其分泌的錳過(guò)氧化物酶、漆酶、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶等胞外酶可有效降解秸稈中的木質(zhì)素，使原本被木質(zhì)素包裹的纖維素、半纖維素釋放出來(lái)。而纖維素酶、木聚糖酶可直接或間接通過(guò)物理或化學(xué)的作用使秸稈整個(gè)纖維結(jié)構(gòu)得到膨脹和破壞。因此，本研究擬使用菌酶復(fù)合制劑對(duì)玉米秸稈進(jìn)行混合發(fā)酵，探討其最佳發(fā)酵條件，以期為提高玉米秸稈的飼用價(jià)值提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種和酶制劑

黃孢原毛平革菌CICC40299購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，活菌數(shù)為1×108CFU/mL;纖維素酶活性≥10000U/g;木聚糖酶活性≥30000U/g。

1.1.2 玉米秸稈

玉米秸稈購(gòu)自大慶市周邊農(nóng)戶(hù)，在自然風(fēng)干后，用粉碎機(jī)切至1～2cm。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng):馬鈴薯浸粉3g，葡萄糖20g，瓊脂14g。黃孢原毛平革菌液體種子培養(yǎng)基:馬鈴薯提取液1L，葡萄糖20g，KH2PO43g，MgSO4·7H2O1.5g，維生素B1微量。121℃滅菌15min。

1.1.4 菌種培養(yǎng)

菌種活化:將黃孢原毛平革菌凍干菌粉接種到PDA培養(yǎng)基上，在28℃條件下培養(yǎng)5d，并轉(zhuǎn)接活化2次，放于4℃保存?zhèn)溆谩Ｒ后w菌種培養(yǎng):將PDA培養(yǎng)基上的黃孢原毛平革菌接種到黃孢原毛平革菌液體種子培養(yǎng)基中，于28℃、150r/min條件下振蕩培養(yǎng)7d。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵條件的篩選

在固態(tài)發(fā)酵條件下，通過(guò)均勻設(shè)計(jì)對(duì)纖維素酶和木聚糖酶添加量、黃孢原毛平革菌接種量以及發(fā)酵天數(shù)進(jìn)行篩選試驗(yàn)，水分含量調(diào)節(jié)至60%～65%。均勻設(shè)計(jì)因素水平見(jiàn)表1。

1.2.2 發(fā)酵條件的驗(yàn)證

將切短至1～2cm的玉米秸稈按均勻設(shè)計(jì)篩選的最佳發(fā)酵條件，添加菌酶復(fù)合制劑，并將水分含量調(diào)節(jié)至60%～65%，裝入33cm×40cm聚乙烯袋內(nèi)，每袋1kg，用真空包裝機(jī)(AT－620)抽真空并封口，室溫下(25～32℃)發(fā)酵19d。發(fā)酵驗(yàn)證試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，開(kāi)封后用于樣品測(cè)定。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分含量的測(cè)定

酸性洗滌木質(zhì)素(ADL)、中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)含量參考范氏洗滌纖維分析法測(cè)定。常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分含量參照《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)》測(cè)定。試驗(yàn)中中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維降解率按以下公式計(jì)算:

中性洗滌纖維降解率(%)=100×［m2－(m1×c1)］/m;

酸性洗滌纖維降解率(%)=100×［m2－(m1×c1)］/m。

式中:m1為空袋質(zhì)量;m為樣品質(zhì)量;m2為提取處理后樣品殘?jiān)?濾袋質(zhì)量;c1為空白袋子校正系數(shù)(烘干后質(zhì)量/原來(lái)質(zhì)量)。

1.3.2 發(fā)酵秸稈感官評(píng)定

開(kāi)封后立即稱(chēng)取發(fā)酵秸稈樣品20g，加入180mL蒸餾水，用均質(zhì)器拍打90s使其充分混勻，再進(jìn)行過(guò)濾，濾液用于測(cè)定飼料pH及有機(jī)酸。按青貯飼料質(zhì)量評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行感官評(píng)定，分別從氣味、色澤、質(zhì)地、含水率、pH進(jìn)行綜合評(píng)定。100分分配:pH為25分，含水量為20分，色澤為20分，氣味為25分，質(zhì)地為10分。75～100分為優(yōu)等，51～76分為良好，26～50為一般，25分及以下為劣質(zhì)。

1.3.3 有機(jī)酸和氨態(tài)氮(NH3-N)濃度的測(cè)定

有機(jī)酸濃度采用安捷倫1200型高效液相色譜儀測(cè)定:有機(jī)酸專(zhuān)用色譜柱300mm×7.8mm，折光檢測(cè)器，柱溫為55℃，壓力為32bar，流速為0.55mL/min;流動(dòng)相為0.1%硫酸水溶液。取經(jīng)低速離心后的秸稈濾液5mL加25%的偏磷酸1mL混勻，取混合液體1mL在4℃、12000r/min離心15min，將上清液用0.22μm水膜緩慢過(guò)濾后，即刻用注樣器上機(jī)測(cè)定有機(jī)酸濃度，上樣量為5μL，通過(guò)外標(biāo)法計(jì)算。氨態(tài)氮濃度參照馮宗慈等的方法測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel 2016軟件整理，采用DPS V7.05軟件的均勻設(shè)計(jì)模塊對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次逐步回歸分析。最佳發(fā)酵條件驗(yàn)證試驗(yàn)運(yùn)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)方法，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2結(jié)果與分析

2.1 回歸方程的建立

中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維降解情況見(jiàn)表2。以纖維素酶(X1)、木聚糖酶(X2)、黃孢原毛平革菌(X3)、發(fā)酵天數(shù)(X4)作為自變量，以中性洗滌纖維降解率(Y1)、酸性洗滌纖維降解率(Y2)作為因變量，利用多元二次逐步回歸建立回歸方程。

中性洗滌纖維降解率的回歸方程:

Y1=7.2729－8.5804X1+0.9266X4－0.2567X2X3。

式中:Y1為中性洗滌纖維降解率(%);X1為纖維素酶添加量(g/kg);X2為木聚糖酶添加量(g/kg);X3為黃孢原毛平革菌接種量(%);X4為發(fā)酵天數(shù)(d)。

經(jīng)優(yōu)化后的發(fā)酵條件分別為X1=0.20、X2=0.12、X3=20、X4=19.07，在優(yōu)化條件下預(yù)測(cè)中性洗滌纖維降解率為22.59%。

酸性洗滌纖維降解率的回歸方程:

Y2=5.7763－8.9204X1+0.9126X4－0.2389X2X3。

式中:Y2為酸性洗滌纖維降解率(%);X1為纖維素酶添加量(g/kg);X2為木聚糖酶添加量(g/kg);X3為黃孢原毛平革菌接種量(%);X4為發(fā)酵天數(shù)(d)。經(jīng)優(yōu)化后的發(fā)酵條件分別為X1=0.20、X2=0.13、X3=20.01、X4=19.24，在優(yōu)化條件下預(yù)測(cè)酸性洗滌纖維降解率為20.80%。

由表3可知，F(xiàn)1，F(xiàn)2＞F24=6.94(a=0.05)，P＜0.05，回歸方程具有顯著意義。理論最佳發(fā)酵條件為:纖維素酶添加量0.2g/kg，木聚糖酶添加量0.1g/kg，黃孢原毛平革菌接種量20%，發(fā)酵天數(shù)19d。

2.2 最佳發(fā)酵條件驗(yàn)證

為了驗(yàn)證試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臏?zhǔn)確性，在上述優(yōu)化條件下進(jìn)行發(fā)酵結(jié)果驗(yàn)證。并繼續(xù)探究菌酶復(fù)合制劑發(fā)酵秸稈的發(fā)酵品質(zhì)。采用上述最佳發(fā)酵條件，實(shí)際測(cè)得觀測(cè)值如表4所示。菌酶復(fù)合制劑發(fā)酵秸稈的粗蛋白質(zhì)、干物質(zhì)含量分別較未發(fā)酵秸稈提高了60.00%和3.75%(P＜0.05)，酸性洗滌木質(zhì)素含量較未發(fā)酵秸稈降低了6.95%(P＜0.05);菌酶復(fù)合制劑發(fā)酵秸稈的中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維含量分別較未發(fā)酵秸稈降低了23.47%、20.13%(P＜0.05)，與預(yù)測(cè)值(22.59%和22.80%)差距不大，試驗(yàn)相對(duì)誤差分別為3.91%、3.22%，相對(duì)誤差較小，可以較好地反映發(fā)酵效果，為以后大規(guī)模發(fā)酵提供理論依據(jù)。

2.3 發(fā)酵品質(zhì)的驗(yàn)證

由表5可知，菌酶復(fù)合制劑發(fā)酵秸稈pH顯著低于未發(fā)酵秸稈(P＜0.05)，表明添加菌酶制劑可有效降低發(fā)酵物的pH;在色澤、氣味、質(zhì)地感官評(píng)價(jià)方面，發(fā)酵秸稈品質(zhì)明顯優(yōu)于未發(fā)酵秸稈，接近優(yōu)質(zhì)發(fā)酵。

2.4 有機(jī)酸和氨態(tài)氮含量

由表6可知，菌酶復(fù)合制劑發(fā)酵秸稈，乳酸含量顯著高于未發(fā)酵秸稈(P＜0.05)，氨態(tài)氮含量顯著低于未發(fā)酵秸稈(P＜0.05)，乙酸、丙酸含量差異不顯著(P＞0.05)，丁酸未檢出。

3討論

均勻設(shè)計(jì)法只考慮試驗(yàn)點(diǎn)在試驗(yàn)范圍內(nèi)均勻分布，與正交試驗(yàn)相比，可大大減少試驗(yàn)次數(shù)，從而節(jié)約時(shí)間、節(jié)約資源，適合用來(lái)優(yōu)化工藝篩選條件。本試驗(yàn)采用均勻設(shè)計(jì)法對(duì)菌酶復(fù)合制劑的最優(yōu)發(fā)酵條件進(jìn)行試驗(yàn)，通過(guò)逐步回歸分析得到菌酶復(fù)合制劑的最佳組合，經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)得到的中性洗滌纖維降解率、酸性洗滌纖維降解率與預(yù)測(cè)值相符。

發(fā)酵飼料成功的關(guān)鍵在于提供適宜的條件。為創(chuàng)造厭氧環(huán)境要把原料壓實(shí)，而水分含量過(guò)低，不易壓實(shí)，所以一般將發(fā)酵飼料適宜的水分含量調(diào)整為65%～70%。本試驗(yàn)通過(guò)黃孢原毛平革菌固體發(fā)酵所產(chǎn)生的3種酶系破壞木質(zhì)素的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，酸性洗滌木質(zhì)素含量降低6.95%，可釋放出纖維素和半纖維素，再利用酶制劑的高效性對(duì)纖維素和半纖維素進(jìn)行降解，以期提高玉米秸稈的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。發(fā)酵結(jié)束后玉米秸稈的感官評(píng)定和營(yíng)養(yǎng)成分含量的變化表明，添加菌酶復(fù)合制劑可以顯著提高發(fā)酵飼料的品質(zhì)。與未發(fā)酵秸稈相比，發(fā)酵后秸稈均具有酸香味、松散不黏手且呈淡黃色。同時(shí)，粗蛋白質(zhì)和干物質(zhì)含量均有所提高，pH、中性洗滌纖維與酸性洗滌纖維含量降低。Song等通過(guò)纖維素酶－木聚糖酶共同處理使玉米秸稈轉(zhuǎn)化率達(dá)到48.5%，并且證實(shí)了纖維素酶－木聚糖酶的協(xié)同作用高于單一酶處理。毛建紅通過(guò)添加纖維素酶、果膠酶、布氏乳酸桿菌發(fā)酵玉米秸稈后，中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、纖維素、半纖維素含量顯著降低，改善了秸稈營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。張仲卿等用擬康寧木霉和黃孢原毛平革菌混合發(fā)酵玉米秸稈，試驗(yàn)表明混合發(fā)酵均高于單一菌株發(fā)酵，其纖維素和木質(zhì)素降解率分別達(dá)到36.80%和28.87%。本試驗(yàn)結(jié)果與上述相關(guān)研究結(jié)果一致。具有不同降解功能的微生物之間存在互生和共生的關(guān)系，將其進(jìn)行適當(dāng)比例的組合可能會(huì)取得更好的應(yīng)用效果。一般認(rèn)為，pH在4.0以下為優(yōu)質(zhì)發(fā)酵飼料。薛艷林等在秸稈發(fā)酵中添加生物制劑可有效提高發(fā)酵飼料品質(zhì)，迅速降低pH，抑制有害微生物的增殖，減少飼料營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損失，使發(fā)酵飼料留存更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。郭萌萌通過(guò)添加乳酸菌、酵母菌、芽孢桿菌等復(fù)合菌發(fā)酵玉米秸稈，將發(fā)酵環(huán)境中pH降低至適宜的pH，從而控制有害菌的增長(zhǎng)。在本研究中，添加黃孢原毛平革菌和纖維素酶后，pH迅速降低，且未出現(xiàn)增高現(xiàn)象，使得發(fā)酵品質(zhì)得到明顯改善。

本試驗(yàn)中，發(fā)酵秸稈乳酸含量顯著高于未發(fā)酵秸稈，乳酸的產(chǎn)量與發(fā)酵飼料的品質(zhì)有直接影響，乳酸的產(chǎn)生可有效抑制其他腐敗菌的生長(zhǎng)。菌酶復(fù)合制劑發(fā)酵秸稈較高的乳酸含量可能由于纖維素酶和黃孢原毛平革菌共同分解植物細(xì)胞壁，從而增加降解菌可利用的發(fā)酵底物，將碳水化合物進(jìn)行生物降解，轉(zhuǎn)化為有機(jī)酸。與未發(fā)酵秸稈相比，在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中菌酶復(fù)合制劑發(fā)酵秸稈的pH較低，這可能導(dǎo)致發(fā)酵秸稈氨態(tài)氮含量降低。本試驗(yàn)結(jié)果與在玉米秸稈青貯中添加乳酸菌及纖維素酶混合發(fā)酵改善青貯發(fā)酵品質(zhì)的結(jié)果一致。

楊世帆等研究表明，乙酸含量產(chǎn)生與青貯品質(zhì)呈負(fù)相關(guān)，對(duì)黃貯也是如此，乙酸會(huì)使發(fā)酵飼料產(chǎn)生酸味，降低適口性，并產(chǎn)生刺鼻的氣味。丁酸是發(fā)酵中應(yīng)盡量避免出現(xiàn)的有機(jī)酸，丁酸是源自含氮化合物的分解，使蛋白質(zhì)分解，并降低其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。本試驗(yàn)中，丙酸和乙酸含量與未發(fā)酵秸稈相比均無(wú)顯著差異，發(fā)酵前后均未檢測(cè)出丁酸，說(shuō)明添加黃孢原毛平革菌和纖維素酶可提高玉米秸稈的發(fā)酵效果，且無(wú)有害酸產(chǎn)生。賈晶霞等在研究玉米秸稈發(fā)酵過(guò)程中粗蛋白質(zhì)含量呈上升趨勢(shì)，這是因?yàn)槲⑸锎罅坷迷现械目扇苄蕴牵闷涞鞍踪|(zhì)較少，從而使粗蛋白質(zhì)相對(duì)含量升高。李川東等認(rèn)為，在發(fā)酵過(guò)程中微生物的相互競(jìng)爭(zhēng)死亡所產(chǎn)生出的菌體蛋白，增加了蛋白質(zhì)含量。岳麗等通過(guò)添加黑曲霉和產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵甜高粱秸稈，將粗蛋白質(zhì)含量提高至18.79%。混合發(fā)酵可產(chǎn)生酶系互補(bǔ)的作用，且對(duì)合成一系列酶過(guò)程具有一定的反饋調(diào)節(jié)作用，從而增加蛋白酶和纖維素酶的活性。本試驗(yàn)中，發(fā)酵秸稈的粗蛋白質(zhì)含量顯著高于對(duì)照組，可能是黃孢原毛平革菌通過(guò)對(duì)木質(zhì)素結(jié)構(gòu)的破壞釋放出來(lái)的纖維素和半纖維被纖維素酶分解為單糖，促進(jìn)菌絲的生長(zhǎng)，增加菌體蛋白，從而提高了發(fā)酵秸稈中粗蛋白質(zhì)的含量。玉米秸稈具有一定的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，但木質(zhì)素、纖維素含量過(guò)高，嚴(yán)重影響其利用價(jià)值。本研究中，發(fā)酵秸稈的酸性洗滌木質(zhì)素、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維含量顯著低于未發(fā)酵秸稈，提高了秸稈的利用價(jià)值。在色澤、氣味、質(zhì)地感官評(píng)價(jià)方面，發(fā)酵秸稈品質(zhì)明顯優(yōu)于未發(fā)酵秸稈，接近優(yōu)質(zhì)發(fā)酵。

4結(jié)論

通過(guò)均勻設(shè)計(jì)篩選出最佳發(fā)酵條件為:纖維素酶添加量0.2g/kg、木聚糖酶添加量0.1g/kg、黃孢原毛平革菌接種量20%、發(fā)酵天數(shù)19d，此條件下中性洗滌纖維降解率為23.47%，酸性洗滌纖維降解率為20.13%。在最佳發(fā)酵條件下，該菌酶復(fù)合制劑發(fā)酵玉米秸稈可顯著提高秸稈的發(fā)酵品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

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