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1.1 主要試劑

MRS培養基( M8330) 、甘油( G8190) ，北京某公司生產; 細菌DNA 提取試劑盒( D3350-01) ，美國某公司生產; 葡萄糖、麥芽糖等常規生化試劑，均購自陜西某公司。

1.2 主要儀器

pH 計( 型號為FE20) ; 分光光度計( 型號為LAMBDA-25) ; 高效液相色譜儀( 型號為1260) ; 生化培養箱( 型號為SNP-250) ; 超凈工作臺( 型號為SW-CG-1FD) 。

1.3 乳酸菌的分離

選擇健康成年散養雞，頸部放血致死，立刻無菌采集回腸和盲腸內容物。稱量10 g 腸道內容物，加入90 mL 無菌磷酸鹽緩沖液( PBS) ，渦旋振蕩5 min，按照10 倍梯度稀釋逐級稀釋( 1×10^-2 ～ 1×10^-6 ) ，然后各取100 μL 均勻涂布于MRS平板中，常氧條件下37 ℃倒置培養48 h。挑取無明顯菌落黏連、融鈣圈明顯、菌落形態和顏色不同的單菌落接種于MRS液體培養基中，劃線純化2 次。純化菌株與30%滅菌甘油按1 ∶1混合后-80 ℃保存，備用。

1.4 乳酸菌的鑒定

備選菌株37 ℃培養18 h，離心收集菌體后利用OMEGA 細菌DNA 提取試劑盒提取菌體DNA。以菌體DNA 為模板，以16S rＲNA 通用引物27F ( 5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 3') 和1 492Ｒ ( 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3') 進行16s rＲNA 片段的擴增，擴增產物測序，測序結果通過NCBI 在線進行BLAST 比對，確定菌株的種屬。

1.5 產酸能力測定

備選菌株37 ℃培養48 h，將100 μL 培養液加入10 mL 改進的MRS 培養液中( 不加乙酸鈉和葡萄糖，但加入35 g /L 麥芽糖、5 g /L 果糖和0.01 g /L 溴酚藍) ， 37 ℃培養，連續觀察4 d，以溴酚藍作為酸堿指示劑記錄培養液顏色變化時的培養時間。在培養90 h以后利用pH 計測定培養液pH 值。為了進一步測定最大產酸量，將100 μL 培養液加入10 mL 改進的MRS培養液( 加入2%的CaCO₃) 中37 ℃ 培養48 h，利用高效液相色譜測定培養液中的乳酸和乙酸含量。

1.6 抑菌試驗

參照李龍等方法進行。將備選菌株按照1%接種于5 mL 的MRS液體培養基中， 37 ℃培養24 h，4 ℃保存，備用。配制固體LB 培養基( 蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，瓊脂15 g，加入純化水定容至1 000 mL) ，每個平板倒入20 mL LB 固體培養基，冷卻，加入過夜培養的病原菌( 大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和巴氏桿菌) 培養液100 μL，均勻涂布于平板表面，平板干燥后等距離放入4 個牛津杯，每個牛津杯中加入200 μL 待測菌液，37 ℃靜置培養24 h，利用游標卡尺測定抑菌圈直徑( mm) 。每個菌株測定3 個重復，以不接種菌液的MRS液體培養基作為陰性對照。

1.7 表面疏水性和耐酸、耐膽鹽性

菌株表面疏水性參照D． Bujnakova 等的方法進行。菌株耐酸、耐膽鹽性參照N． Azami 等的方法進行。利用96 孔微孔板，分別加入200 μL MRS液體培養基( pH 值= 6.3) ，200 μL pH 值為2.5 的MRS液體培養基， 200 μL MRS液體培養基和200 μL含2%牛膽汁的MRS液體培養基( pH 值= 6.3) ，每孔加入1×10⁶cfu 的待測菌株，每個菌株重復3 次，培養24 h 后通過平板計數和在600 nm 處測定吸光度檢測活菌數量和菌株生長情況。

1.8 發酵飼料制備和細菌計數

參照NＲC( 1997) 飼養標準配制肉雞飼養前期( 0～21 d) 飼料配方，基礎日糧中無抗生素添加( 試驗基礎日糧組成及營養水平見表1) 。以備選菌株作為發酵菌種，發酵菌株的添加量為1×10⁷cfu /kg，料水比為1 ∶1.5，密閉于飼料發酵袋中， 37 ℃培養72 h，每個菌株做3 個重復。分別在0，8，24， 48， 72 小時取樣測定發酵飼料pH 值、乳酸菌數量和乙酸、乳酸含量。發酵飼料pH 值測定參照劉曉明的方法進行，乳酸菌計數采用MRS平板計數法，乳酸和乙酸含量利用高效液相色譜法進行測定。

1.9 數據的統計與分析

采用SPSS 17.0 對數據進行統計分析，采用One-Way ANOVA 進行方差分析，LSD 法進行多重比較，試驗結果以“平均值±標準差”表示。

2.1 乳酸菌的分離與鑒定

通過形態和分子生物學鑒定，試驗共從肉雞胃腸道中分離得到98 株乳酸菌菌株，依次編號為FJ-1 至FJ- 98，其中唾液乳桿菌( Lactobacillus salivarius )19 株，羅伊乳桿菌( Lactobacillus reuteri) 17 株，約氏乳桿菌( Lactobacillus johnsonii) 14 株，植物乳桿菌( Lactobacillusplantarum) 9 株，干酪乳桿菌( Lactobacillusreuteri) 7 株，糞腸球菌( Enterococcus faecium) 20 株，屎腸球菌( Enterococcus faecium) 12 株。

2.2 產酸能力測定

通過對98株分離乳酸菌菌株產酸能力測定發現，不同的菌株產酸能力差異很大，指示劑變色時間范圍從17h(FJ-66)到88h(FJ-33)，乳酸的產量范圍從18mmol/L(FJ-22)到269mmol/L(FJ-38)，依據各菌株的產酸速度和乳酸濃度的高低，最終選出8株產酸特性好的乳酸菌菌株進行后續試驗。8株乳酸菌菌株產酸特性測定結果見表2。

由表5可知:在發酵前飼料的pH值為6.2，37℃發酵24小時菌株發酵組的pH值均降低，其中FJ-38和FJ-92較低，并且顯著低于對照組(P＜0.05);發酵72小時所有菌株發酵組pH值均顯著低于對照組(P＜0.05)，其中FJ-38和FJ-92較低。

發酵24小時所有菌株發酵組乳酸產量均顯著高于對照組(P＜0.05)，72小時乙酸含量顯著低于對照組(P＜0.05)，但在發酵72小時FJ-38和FJ-92菌株處理組乳酸產量較高，顯著高于其他處理組(P＜0.05)，所有菌株發酵組乳酸產量均顯著高于對照組(P＜0.05);FJ-67菌株雖然在之前的產酸性能測定上表現出了較強的產乳酸能力，但在飼料發酵試驗中其產酸能力低于其他菌株發酵組;在發酵24小時和72小時，所有菌株發酵組乳酸菌數量均顯著高于對照組(P＜0.05)，其中FJ-38和FJ-92在發酵72小時乳酸菌數量均超過1x10⁹cfu/mL。

發酵飼料是在飼料中接種不同的菌種在適當的溫度下自然發酵而成的飼料，不同的接種物對發酵飼料的性質有很大影響，本研究旨在篩選適合家禽發酵飼料的接種菌株。由于高的乳酸濃度和低的pH值是發酵飼料發揮抑菌特性的重要原因，因此本試驗首先對分離到的乳酸菌菌株進行了產酸能力分析，然后才進行了抑菌試驗和耐酸、耐膽鹽試驗。在本試驗中利用5株篩選到的菌株進行飼料發酵試驗，但所有乳酸菌發酵飼料乳酸含量均未能達到150mmol/L。但有研究結果表明，為有效降低病原菌濃度(大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌)，發酵飼料中乳酸的濃度必須大于100mmol/L，本試驗中有4株乳酸菌達到此要求，其中FJ-38和FJ-92菌株最接近乳酸濃度150mmol/L的要求。但在發酵試驗中，不同的飼料組成或料水比可能都會影響到最終發酵飼料的乳酸濃度，因此100mmol/L乳酸濃度作為評判發酵飼料優劣可能更優于150mmol/L。乙醇的產生會引起發酵飼料異味或干物質的損失，但本試驗考慮到家禽味覺系統不發達，因此未對該指標進行測定分析。

雖然本試驗分離到的部分菌株產酸能力很強，但其是否能在家禽消化道發揮一定的益生特性有待研究。益生菌菌株應具備良好的酸和膽鹽耐受力，并對腸上皮細胞具有良好的黏附特性。因此，本試驗還測定了候選菌株的耐酸(pH值=2.5)、耐膽鹽(2%牛膽汁)和表面疏水性，表面疏水性與益生菌黏附腸上皮細胞能力呈現明顯的正相關，結果發現，有5株菌株(FJ-38、FJ-54、FJ-67、FJ-85和FJ-92)表現出了良好的益生特性。結合飼料發酵的結果發現，FJ-38和FJ-92無論從發酵效果和益生特性上在所有候選菌株中表現效果均最好。

雖然本試驗發現2株可能作為肉雞發酵飼料的候選菌株，但其在使用前還需要進一步深入研究。首先要進行耐藥性檢測，因為目前研究發現，乳酸菌同樣能通過水平基因轉移引發耐藥基因的傳播，帶來潛在風險;其次，優化料水比并進行大規模發酵試驗，進一步確定其在生產中的使用效果;最后，還要進一步驗證其在低溫環境下的發酵效果，因為很多養殖場缺乏必要的加熱設備，在自然環境溫度的作用下其發酵效果可能會出現差異。