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復(fù)合菌生物飼料包含幾個微生物群：酵母菌、乳酸菌、芽孢桿菌以及雙岐桿菌等。這種微生物群在生命活動中產(chǎn)生的多種酶，如淀粉酶、胃蛋白酶等，將飼料中的淀粉、蛋白質(zhì)等大分子有機物質(zhì)降解為小分子的單糖、雙糖、各種氨基酸及其他營養(yǎng)物質(zhì)，使畜禽更易于吸收。

植物乳桿菌是一種常見于面包、肉類及許多蔬菜發(fā)酵制品中的乳酸菌，能通過胃并定植于腸道發(fā)揮有益作用。它對腸道微生物有重要影響，在食品發(fā)酵和工業(yè)乳酸發(fā)酵領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。酵母是一類結(jié)構(gòu)簡單的真菌類微生物，廣泛應(yīng)用于食品和飼料工業(yè)。一些科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，酵母菌或其提取的甘露糖蛋白具有顯著非特異性免疫調(diào)節(jié)和營養(yǎng)功能。腐植酸鈉作為一種新型的飼料添加劑廣泛應(yīng)用于飼料工業(yè)。本試驗以玉米皮、棉籽粕、玉米粉、麩皮、稻殼和糖蜜為原料配制培養(yǎng)基，以植物乳桿菌與酵母菌為發(fā)酵菌種，通過探索發(fā)酵產(chǎn)物中的活菌數(shù)來研究復(fù)合菌生物飼料發(fā)酵的最適條件。

１.１　材料

１.１.１　菌種

植物乳桿菌（Lactobacillus　plantarum），由北京和美科盛生物技術(shù)有限公司保存并提供。酵母菌由內(nèi)蒙古斯隆生物技術(shù)有限責(zé)任公司保存與提供。

１.１.２　原料

玉米皮、棉籽粕、玉米粉、麩皮、稻殼和糖蜜由內(nèi)蒙古斯隆生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供。腐植酸鈉由內(nèi)蒙古永業(yè)生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供。

１.１.３　培養(yǎng)基

ＭＲＳ液體培養(yǎng)基（１Ｌ）：蛋白胨１０ｇ，牛肉膏５ｇ，酵母粉４ｇ，葡萄糖２０ｇ，吐溫－８０１ｇ，磷酸氫二鉀２ｇ，檸檬酸氫二氨２ｇ，乙酸鈉５ｇ，硫酸鎂０．２ｇ，硫酸錳０．０５ｇ，蒸餾水１０００ｍｌ。植物乳桿菌斜面培養(yǎng)基（１Ｌ）：在ＭＲＳ液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加２％瓊脂粉，在溫度１２１℃條件下滅菌１５ｍｉｎ。酵母菌培養(yǎng)基：麥芽汁培養(yǎng)基和麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。原料發(fā)酵培養(yǎng)基（１ｋｇ）：玉米皮３５０ｇ，棉籽粕８０ｇ，玉米粉１００ｇ，麩皮１７０ｇ，稻殼２００ｇ，糖蜜１００ｇ。

１.１.４　儀器

恒溫培養(yǎng)箱、恒溫振蕩器、超凈工作臺、分析天平（感量０.０００１ｇ）、粉碎機和蒸汽滅菌鍋等。

１.２　方法

１.２.１　菌種的活化及種子液的制備

植物乳桿菌：將冷凍保存的菌種接種于ＭＲＳ斜面培養(yǎng)基中，３７℃靜置培養(yǎng)４８ｈ；待形成菌落后挑取單個菌落接種于ＭＲＳ液體培養(yǎng)基中，在溫度３７℃條件下培養(yǎng)２４ｈ，即得種子液。

酵母菌：將冷凍保存的菌種接種于麥芽汁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，３２℃靜置培養(yǎng)４８ｈ，待形成菌落后挑取單個菌落接種于麥芽汁液體培養(yǎng)基中，在溫度３２℃條件下振蕩培養(yǎng)２４ｈ，即得種子液。

１.２.２　實驗設(shè)計

１.２.２.１　菌種比例的優(yōu)化

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基不變的條件下，設(shè)置植物乳桿菌和酵母菌不同的菌種比例，分別為１︰９、３︰７、１︰１、７︰３和９︰１，其他發(fā)酵條件一致，最后裝入規(guī)格為２５０ｍｌ的錐形瓶中進行固態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵３６ｈ后通過測定發(fā)酵產(chǎn)物中的活菌數(shù)來確定最佳菌種比例。

１.２.２.２　裝料量的優(yōu)化

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基不變的條件下，設(shè)置不同的裝料量，分別為３０、４０、５０、６０和７０ｇ，其他發(fā)酵條件一致，最后裝入規(guī)格為２５０ｍｌ的錐形瓶中進行固態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵３６ｈ后測定發(fā)酵產(chǎn)物中活菌數(shù)，以確定最佳裝料量。

１.２.２.３　發(fā)酵底物含水量的優(yōu)化

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基不變的條件下，設(shè)置發(fā)酵底物不同的含水量，分別為４０％、４５％、５０％、５５％和６０％，其他發(fā)酵條件一致，最后裝入規(guī)格為２５０ｍｌ的錐形瓶中進行固態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵３６ｈ后通過測定發(fā)酵產(chǎn)物中的活菌數(shù)來確定發(fā)酵底物的最佳含水量。

１.２.２.４　發(fā)酵溫度的優(yōu)化

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基不變的條件下，設(shè)置不同的發(fā)酵溫度，分別為２６、３０、３４、３８和４２℃，其他發(fā)酵條件一致，最后裝入規(guī)格為２５０ｍｌ的錐形瓶中進行固態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵３６ｈ后通過測定發(fā)酵產(chǎn)物中的活菌數(shù)來確定發(fā)酵的最佳溫度。

１.２.２.５　發(fā)酵菌種接種量的優(yōu)化

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基不變的條件下，設(shè)置不同的菌種接種量，分別為６％、８％、１０％、１２％和１４％，其他發(fā)酵條件一致，最后裝入規(guī)格為２５０ｍｌ的錐形瓶中進行固態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵３６ｈ后通過測定發(fā)酵產(chǎn)物中的活菌數(shù)來確定菌種的最佳接種量。

１.２.２.６　腐植酸鈉添加量的優(yōu)化

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基不變的條件下，設(shè)置腐植酸鈉不同的添加量，分別為２％、４％、６％、８％和１０％，其他發(fā)酵條件一致，最后裝入規(guī)格為２５０ｍｌ的錐形瓶中進行固態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵３６ｈ后通過測定發(fā)酵產(chǎn)物中的活菌數(shù)來確定發(fā)酵底物的最佳腐植酸鈉添加量。

１.２.３　分析方法

活菌數(shù)的測定：稱取５ｇ發(fā)酵產(chǎn)物溶于４５ｍｌ滅菌的生理鹽水中，振蕩混勻，靜置，吸取上清液分別進行乳酸菌和酵母菌活菌數(shù)的測定，采用平皿稀釋涂布計數(shù)法。

２.１　菌種比例的優(yōu)化

植物乳桿菌和酵母菌分別以不同的接種比例發(fā)酵生物飼料，其產(chǎn)物中活菌數(shù)的結(jié)果見圖１。

從圖１ 可以看出，植物乳桿菌和酵母菌以１︰１的比例混合發(fā)酵時，產(chǎn)物中兩種菌的活菌數(shù)最高，酵母菌為10×10⁸ ｃｆｕ／ｇ，植物乳桿菌的活菌數(shù)為１７.４×１０⁸ ｃｆｕ／ｇ。植物乳桿菌與酵母菌復(fù)合發(fā)

酵，酵母菌為兼性厭氧菌，植物乳桿菌為厭氧菌，發(fā)酵剛開始時酵母菌利用發(fā)酵底物中的氧氣快速生長；當(dāng)氧氣消耗完后植物乳桿菌大量繁殖，產(chǎn)生的大量乳酸使發(fā)酵底物中的ｐＨ 值下降，酵母菌的生長受到限制。所以，這兩種菌同時發(fā)酵后產(chǎn)物中的植物乳桿菌的活菌數(shù)比酵母菌的高。

２.２　裝料量的優(yōu)化

不同裝料量對發(fā)酵產(chǎn)物中兩種菌的活菌數(shù)的影響見圖２。

由圖２可以看出，在２５０ｍｌ的錐形瓶中，裝料量為５０ｇ時，產(chǎn)物中植物乳桿菌的活菌數(shù)最高，達１５.８×１０⁸ ｃｆｕ／ｇ。裝料量為４０ｇ時，酵母菌的活菌數(shù)最高，達９×１０⁸ ｃｆｕ／ｇ；但植物乳桿菌的活菌數(shù)是所有組中最低的。在５０、４０ｇ裝料量條件下產(chǎn)物中酵母菌的活菌數(shù)分別為７.２×１０⁸ 和９×１０⁸ ｃｆｕ／ｇ。

綜合兩種菌的生長情況，得出最優(yōu)裝料量為５０ｇ。裝料量直接影響了發(fā)酵底物的厚度。底物厚度小，菌體與空氣充分接觸，適合酵母菌的生長；底物厚度大，底部的菌體很難與空氣接觸，氧氣少，適合植物乳桿菌生長。

２.３　發(fā)酵底物水分含量的優(yōu)化

微生物在發(fā)酵過程中需要有適宜的水分。發(fā)酵底物環(huán)境中的水分直接影響微生物的生長情況。發(fā)酵底物中不同的水分含量對發(fā)酵產(chǎn)物中活菌數(shù)的影響見圖３。

從圖３可以看出，發(fā)酵底物水分為５０％時，發(fā)酵產(chǎn)物中植物乳桿菌的活菌數(shù)最高，達１７.３×１０⁸ ｃｆｕ／ｇ。發(fā)酵底物中水分為４５％和５０％時，酵母菌的活菌數(shù)分別為１４.３ × １０⁸ 、１４×１０⁸ ｃｆｕ／ｇ，與其他各組相比均達到較高水平。綜合兩種菌的生長情況，得出發(fā)酵底物中的水分為５０％時最優(yōu)。

２.４　發(fā)酵溫度的優(yōu)化

發(fā)酵溫度對發(fā)酵產(chǎn)物中活菌數(shù)的影響見圖４。

從圖４可以看出，發(fā)酵溫度為３４、３８和４２℃時，植物乳桿菌的活菌數(shù)較高，但酵母菌的生長受到抑制；相反，在較低溫度２６℃時酵母菌的生長優(yōu)于植物乳桿菌。綜合考慮兩種菌生長的情況，在３４℃時植物乳桿菌數(shù)量最高，達到１８.２×１０⁸ ｃｆｕ／ｇ，酵母菌也達到最高水平１１.４×１０⁸ ｃｆｕ／ｇ。因此，選擇３４℃為最佳發(fā)酵溫度。溫度是影響微生物生長和存活的關(guān)鍵因素，微生物在最適的溫度條件下才能生長得最好。溫度過高會使微生物菌體中的蛋白質(zhì)變性或受到不同程度的破壞，降低微生物的繁殖速度；溫度過低又抑制了酶的活性，蛋白質(zhì)的合成速度受到限制，也影響微生物的生長繁殖。

２.５　發(fā)酵菌種接種量的優(yōu)化

植物乳桿菌和酵母菌的接種量對發(fā)酵產(chǎn)物中活菌數(shù)的影響見圖５。

從圖５中可以看出，接種量為１０％ 時，發(fā)酵產(chǎn)物中植物乳桿菌和酵母菌的活菌數(shù)都達到最高，分別為１７.１×１０⁸ 和１４.０×１０⁸ ｃｆｕ／ｇ 。接種量為１４％組和１０％組的植物乳桿菌數(shù)活菌數(shù)相差不大，但酵母菌數(shù)１４％組明顯低于其他各組。因此，綜合考慮兩種菌的生長情況，且為了降低生產(chǎn)成本，選擇最優(yōu)接種量為１０％。

２.６　腐植酸鈉添加量的優(yōu)化

腐植酸鈉不同添加量對發(fā)酵產(chǎn)物中活菌數(shù)的影響見圖６。

從圖６可以看出，腐植酸鈉添加量為２％ 時，發(fā)酵產(chǎn)物中的植物乳桿菌和酵母菌的活菌數(shù)含量最高，分別為１７.５９×１０⁸ 和８.８４×１０⁸ ｃｆｕ／ｇ，均高于腐植酸鈉０％組。添加４％、６％和８％的腐植酸鈉組，發(fā)酵產(chǎn)物中兩種菌的活菌數(shù)均低于０％組。說明腐植酸鈉含量過高可能抑制了這兩種菌的生長。

由此可見，腐植酸鈉的添加量對微生物的生長影響很大，本試驗腐植酸鈉最適合的添加量為２％。腐植酸鈉對細(xì)菌、酵母菌及放線菌有刺激生長、促進繁殖、加速新陳代謝的作用。腐植酸作為增效劑在釀酒工業(yè)上能促進酵母細(xì)胞的繁殖，提高酒母的生產(chǎn)能力，說明添加一定量的腐植酸鈉可以促進微生物的生長。

（１）玉米皮、棉籽粕、玉米粉、麩皮、稻殼和糖蜜等發(fā)酵原料確定后，菌種的比例、裝料量、發(fā)酵底物水分含量、發(fā)酵溫度、接種量和腐植酸鈉添加量等發(fā)酵條件的優(yōu)化是提高產(chǎn)物中益生菌數(shù)的重要因素。

（２）本試驗得出復(fù)合菌生物飼料的最佳發(fā)酵工藝條件為：植物乳桿菌和酵母菌的接種比例為１︰１，裝料量５０ｇ，發(fā)酵底物含水量５０％，發(fā)酵溫度３４℃，接種量１０％，腐植酸鈉添加量２％。在此條件下的復(fù)合菌生物飼料中含有植物乳桿菌１７.５９×１０⁸ ｃｆｕ／ｇ，酵母菌８.８４×１０⁸ ｃｆ／ｇ。